Un protocollo per la separazione di ectoderma dell'embrione del viso e del mesenchima è descritto. Usiamo dispasi II per il trattamento di embrioni interi in primo luogo, analizzare interi protuberanze del viso, e poi separare il viso ectoderma e mesenchima.
Schisi oro-facciali sono i difetti più frequenti cranio-facciali, che colpiscono 1,5 nel 1000 1,2 neonati in tutto il mondo. Palatoschisi orofacciale è causata da abnorme 3 Sviluppo del viso. In mouse e dell'essere umano, la crescita iniziale ed il modello del volto si basa su diversi piccoli boccioli di tessuto, le sporgenze del viso 4,5. Il volto è derivato da sei coppie di protuberanze principali: i processi frontali nasali (FNP), protuberanze mascellari (MXP) e protuberanze mandibolari (MdP). Tali prominenze consistono rigonfiamenti di mesenchima che sono incassati in un epitelio sovrastante. Gli studi condotti su specie diverse hanno dimostrato che la segnalazione crosstalk tra ectoderma e mesenchima del viso è fondamentale per plasmare il volto 6. Tuttavia, i dettagli meccanicistici riguardanti i geni coinvolti in questi relè di segnalazione sono carenti. Un modo per ottenere una comprensione globale di espressione genica, il fattore di trascrizione vincolante e marchi associati alla cromatina sviectoderma ping viso e mesenchima è quello di isolare e caratterizzare i compartimenti separati.
Qui vi presentiamo un metodo per separare ectoderma del viso e del mesenchima al giorno embrionale (E) 10.5, una fase critica dello sviluppo nella formazione del mouse facciale che precede la fusione delle protuberanze. Il nostro metodo è adattato da un approccio che abbiamo utilizzato in precedenza per sezionare protuberanze facciali 7. In questo studio abbiamo utilizzato inbred C57BL / 6 topi come questo ceppo è diventato uno standard per la genetica, la genomica e la morfologia del viso 8. Qui, tuttavia, sia per le quantità più limitata di tessuto disponibili, abbiamo utilizzato la outbred CD-1 ceppo che è conveniente per l'acquisto, più robusto per l'allevamento, e tende a produrre più embrioni (12-18) per cucciolata di qualsiasi inbred topo strain 8. Dopo aver isolato embrione, neutro proteasi dispasi II è stato usato per trattare l'embrione intero. Poi, le protuberanze facciali sono stati sezionareed out, e l'ectoderma facciale è stato separato dal mesenchima. Questo metodo mantiene sia l'ectoderma e mesenchima viso intatto. I campioni cosi ottenuti possono essere utilizzati per le tecniche di rilevamento tra proteine, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) assay, studi di microarray, e RNA-seq.
Questo protocollo fornisce un metodo semplice per separare ectoderma embrionale del mouse e mesenchima facciale sulla base di una prima fase di trattamento dispasi II. In studi precedenti, abbiamo svolto dissezione delle protuberanze del viso prima del trattamento dispasi II, ma abbiamo sempre trovato che il mesenchima diventa "appiccicoso" e più difficile da manipolare. Il nostro nuovo protocollo evita questo problema. Combinazione dispasi II trattamento con dolce forza fisica pipettando su e giù rende sepa…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Irene Choi per illustrare le teste di embrioni in Fig. 1 e gli altri membri del laboratorio per l'aiuto e la discussione. Questo lavoro è sostenuto da NIH sovvenzione DE012728 (TW)
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |