Le variazioni muscolari degli arti proprietà contrattili e passiva meccanici sono biomarcatori importanti per le malattie muscolari. Questo manoscritto descrive test fisiologici per misurare queste proprietà nel lungo delle dita estensore murino e tibiale muscoli anteriori.
I movimenti del corpo sono forniti principalmente da funzione meccanica del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico è costituito da fasci numerose miofibre che sono rivestite da tessuti connettivi intramuscolari. Ogni miofibre contiene miofibrille molti che corrono longitudinalmente lungo la lunghezza del miofibre. Miofibrille sono l'apparato contrattile del muscolo e sono composti da unità ripetute contrattili dette sarcomeri. Un'unità sarcomero contiene filamenti di actina e miosina che sono distanziati dai dischi Z e proteine titin. Funzione meccanica del muscolo scheletrico è definito dalle proprietà contrattili del muscolo e passiva. Le proprietà contrattili vengono utilizzati per caratterizzare la quantità di forza generata durante la contrazione muscolare, il tempo di generazione della forza e del tempo di rilassamento muscolare. Qualsiasi fattore che influenza la contrazione muscolare (come ad esempio l'interazione tra filamenti di actina e miosina, omeostasi del calcio, ATP / ADP rapporto, ecc) influenza la prope contrattileproprietā. Le proprietà passive si riferiscono alle proprietà elastiche e viscoso (rigidità e viscosità) del muscolo in assenza di contrazione. Queste proprietà sono determinate dal extracellulare e le componenti strutturali intracellulari (come titin) e tessuti connettivi (principalmente collagene) 1-2. Le proprietà contrattili e passiva sono due aspetti inseparabili della funzione muscolare. Per esempio, la flessione del gomito è compiuta dalla contrazione dei muscoli nel vano anteriore del braccio e allungamento passivo dei muscoli nel vano posteriore del braccio. Per comprendere veramente la funzione muscolare, entrambe le proprietà contrattili e passivo dovrebbe essere studiata.
Le proprietà contrattili e / o passivi meccaniche di muscoli sono spesso compromesse nelle malattie muscolari. Un buon esempio è la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), un muscolo grave deperimento causata da carenza di distrofina 3. Distrofina è una prote citoscheletricain che stabilizza la membrana delle cellule muscolari (sarcolemma) 4 durante la contrazione muscolare. In assenza di distrofina, il sarcolemma viene danneggiato dalla forza di taglio generata durante la trasmissione della forza. Questa membrana strappo inizia una reazione a catena che porta alla morte delle cellule muscolari e perdita di macchinari contrattile. Di conseguenza, si riduce la forza muscolare e miofibre morti sono sostituiti dai tessuti fibrotici 5. Questa modifica in seguito aumenta la rigidità muscolare 6. Misurazione accurata di questi cambiamenti fornisce guida importante per valutare la progressione della malattia e per determinare l'efficacia terapeutica del nuovo gene / cellulare / interventi farmacologici. Qui, vi presentiamo due metodi per valutare entrambe le proprietà contrattili e passiva meccaniche del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) muscolare e le proprietà contrattili del tibiale anteriore (TA) muscolare.
In questo protocollo, abbiamo illustrato saggi fisiologici per misurare le proprietà contrattili e passive del muscolo EDL e le proprietà contrattili del muscolo TA. Una delle principali preoccupazioni in studi di fisiologia muscolare è l'ossigenazione del muscolo bersaglio. Per grandi muscoli (come il muscolo TA), il nell'approccio situ è preferito perché la diffusione dell'ossigeno dal buffer di Ringer non può raggiungere il centro del muscolo in un test in vitro. Nell'approccio situ non disturba alimentazione normale sangue e ipossia associata effetti artificiali sono evitati. Il muscolo EDL è uno dei muscoli più comunemente usato in studio fisiologia. Un'adeguata ossigenazione del muscolo intero può essere realizzato in un sistema in vitro a causa delle piccole dimensioni del muscolo. Inoltre, il sistema in vitro fornisce un ambiente chiuso per manipolare le concentrazioni di ioni (Ca 2 +, Na + e K +) e chimicicals (ATP e glucosio) che sono necessari per la generazione di forza muscolare ottimale. Questo offre una grande opportunità per studiare l'effetto di queste variabili sulla produzione di forza.
Misurazione accurata delle proprietà contrattili e passivo del muscolo degli arti è fondamentale per studiare la funzione del muscolo scheletrico. Cambiamenti caratteristici di queste proprietà sono spesso considerati come i tratti distintivi di varie malattie muscolari. I cambiamenti in questi parametri sono indicatori importanti per determinare se una terapia sperimentale è efficace o meno.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (AR-49419, DD), Distrofia Muscolare Association (DD), la formazione e la NIH sovvenzione T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.