Änderungen in den Extremitäten Muskeln kontraktilen und passiven mechanischen Eigenschaften sind wichtige Biomarker für Muskelerkrankungen. Dieses Manuskript beschreibt physiologischen Tests, um diese Eigenschaften in der murinen extensor digitorum longus und tibialis anterior messen.
Körperbewegungen werden hauptsächlich durch mechanische Funktion Skelettmuskel vorgesehen ist. Skelettmuskulatur besteht aus zahlreichen Bündel von Muskelfasern, die durch intramuskuläre Bindegewebe ummantelt zusammengesetzt sind. Jedes myofiber enthält viele Myofibrillen, die in Längsrichtung verlaufen entlang der Länge des myofiber. Myofibrillen sind die kontraktilen Apparates von Muskel-und sie wiederholten kontraktilen Einheiten Sarkomere bekannt komponiert. Ein Sarkomer Gerät enthält Aktin und Myosin-Filamente, die durch die Z-Discs und Titin-Protein beabstandet sind. Mechanische Funktion der Skelettmuskel von den kontraktilen und passiven Eigenschaften des Muskels definiert. Die kontraktilen Eigenschaften werden verwendet, um die Größe der Kraft während der Muskelkontraktion, die Zeit des Krafterzeugung und Zeit der Muskelentspannung erzeugt charakterisieren. Jeder Faktor, Muskelkontraktion (wie Wechselwirkung zwischen Aktin und Myosin-Filamente, Homöostase von Calcium, ATP / ADP-Verhältnis usw.) beeinflusst beeinflusst die kontraktilen properties. Die passiven Eigenschaften beziehen sich auf die elastischen und viskosen Eigenschaften (Steifigkeit und Viskosität) des Muskels in Abwesenheit von Kontraktion. Diese Eigenschaften werden durch die extrazellulären und intrazellulären den strukturellen Komponenten (wie Titin) und Bindegewebe (insbesondere Kollagen) 1-2 bestimmt. Die kontraktilen und passiven Eigenschaften sind zwei untrennbare Aspekte der Muskelfunktion. Beispielsweise wird Ellenbogenflexion durch Kontraktion von Muskeln im vorderen Abteil der Oberarm und passive Dehnung von Muskeln in der hinteren Kammer des Oberarms erreicht. Um wirklich zu verstehen Muskelfunktion, sollten beide kontraktilen und passiven Eigenschaften untersucht werden.
Die Kontraktilität und / oder passiven mechanischen Eigenschaften des Muskels sind auch an Muskelerkrankungen kompromittiert. Ein gutes Beispiel ist die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), einer schweren Muskelschwund Krankheit durch Dystrophin-Mangel 3 verursacht. Dystrophin ist ein Zytoskelett protedaß stabilisiert die Muskelzellmembran (Sarkolemm) während der Muskelkontraktion 4. In Abwesenheit von Dystrophin, wird die Sarkolemm durch die Scherkraft während Kraftübertragung erzeugten beschädigt. Diese Membran reißt initiiert eine Kettenreaktion, die Muskelzelle Tod und Verlust der kontraktilen Maschinen führt. Als Folge davon wird Muskelkraft reduziert und toten Muskelfasern werden durch fibrotischen Geweben 5 ersetzt. Diese spätere Änderung erhöht Muskelsteifheit 6. Genaue Messung dieser Veränderungen bietet wichtige Orientierungshilfe bis zur Krankheitsprogression zu bewerten und therapeutische Wirksamkeit von neuartigen Gen / Zelle / pharmakologische Interventionen zu bestimmen. Hier präsentieren wir zwei Methoden, um sowohl kontraktilen und passiven mechanischen Eigenschaften des extensor digitorum longus (EDL) Muskel-und der kontraktilen Eigenschaften des tibialis anterior (TA) Muskeln zu bewerten.
In diesem Protokoll haben wir physiologischen Assays zur Messung der Kontraktionskraft und passiven Eigenschaften die EDL Muskel und die kontraktilen Eigenschaften des Muskels TA dargestellt. Ein wichtiges Anliegen in der Muskelphysiologie Studien ist die Sauerstoffversorgung des Zielmuskel. Für große Muskeln (z. B. die TA-Muskel), wird die in situ-Ansatz bevorzugt, da Sauerstoffdiffusion von Ringer-Puffer nicht erreichen kann die Mitte des Muskels in einem in vitro-Assay. In situ-Ansatz nicht stört normalen Blutzufuhr und Hypoxie-assoziierten künstlichen Effekte vermieden werden. Die EDL Muskel ist einer der am häufigsten verwendeten Muskeln in der Physiologie Studie. Ausreichende Sauerstoffversorgung des gesamten Muskel kann in einem in vitro-System werden wegen der geringen Größe des Muskels erreicht. Ferner stellt die in vitro-System einen geschlossenen Umgebung, um die Konzentrationen von Ionen (Ca 2 +, Na + und K +) manipulieren und chemischcals (ATP und Glucose), die notwendig für eine optimale Muskelkraft Generation. Dies bietet eine gute Gelegenheit, um die Wirkung dieser Variablen auf die Kraftentwicklung zu studieren.
Genaue Messung der Kontraktionskraft und passiven Eigenschaften des Schenkels Muskel ist kritisch für Skelettmuskelfunktion studieren. Charakteristische Veränderungen dieser Eigenschaften werden oft als Kennzeichen der verschiedenen Muskelerkrankungen betrachtet. Veränderungen dieser Parameter sind auch wichtige Indikatoren, um zu bestimmen, ob eine experimentelle Therapie wirksam ist oder nicht.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AR-49419, DD), Gesellschaft für Muskeldystrophie (DD) und NIH Ausbildungsförderung T90DK70105 (CH) unterstützt.
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.