Veranderingen in de ledematen spieren contractiele en passieve mechanische eigenschappen zijn belangrijk biomarkers voor spierziekten. Dit manuscript beschrijft fysiologische tests om deze eigenschappen te meten in het muizen extensor digitorum longus en m. tibialis anterior.
Bewegingen van het lichaam worden voornamelijk geleverd door de mechanische werking van de skeletspieren. Skeletspier bestaat uit verschillende bundels myovezels die ommanteld door intramusculaire bindweefsel. Elke myofiber bevat vele myofibrillen die in de lengte langs de lengte van de myofiber. Myofibrillen zijn het contractiele apparaat van spieren en zij bestaan uit herhaalde eenheden bekend als contractiele sarcomeren. Een sarcomeer eenheid bevat actine en myosine filamenten die zijn verdeeld door de schijven en Z titin eiwit. Mechanische functie van skeletspier wordt bepaald door de contractiele en passieve eigenschappen van de spier. De contractiele eigenschappen worden gebruikt om de hoeveelheid kracht die tijdens spiercontractie tijd troepenmacht en tijd van spierontspanning karakteriseren. Elke factor die spiercontractie (zoals interactie tussen actine en myosine filamenten, homeostase van calcium, ATP / ADP verhouding, etc.) beïnvloedt beïnvloedt de contractiele properties. De passieve eigenschappen verwijzen de elastische en visceuze eigenschappen (stijfheid en viscositeit) van de spier in afwezigheid van krimp. Deze eigenschappen worden bepaald door de extracellulaire en intracellulaire structurele componenten (zoals titin) en bindweefsel (vooral collageen) 1-2. De contractiele en passieve woningen zijn twee onafscheidelijke aspecten van spierfunctie. Zo wordt flexie bereikt door samentrekking van spieren in het voorste compartiment van de bovenarm en passieve rek van de spieren in het achterste compartiment van de bovenarm. Om echt te begrijpen spierfunctie, moeten zowel contractiele en passieve eigenschappen worden bestudeerd.
De contractie en / of passieve mechanische eigenschappen van de spier worden vaak gecompromitteerd in spierziekten. Een goed voorbeeld is de ziekte van Duchenne (DMD), een ernstige spier slopende ziekte veroorzaakt door tekort aan dystrofine 3. Dystrofine een cytoskelet protein dat stabiliseert de spiercelmembraan (sarcolemma) tijdens spiercontractie 4. In afwezigheid van dystrofine, wordt de sarcolemma beschadigd door de afschuifkracht gegenereerd tijdens overbrenging. Dit membraan scheuren start een kettingreactie die leidt tot spier-celdood en verlies van contractiele machines. Bijgevolg wordt spierkracht verminderd en dode myovezels vervangen door fibrotisch weefsel 5. Deze latere verandering is een verbetering spierstijfheid 6. Nauwkeurige meting van deze veranderingen geeft belangrijke leidraad voor progressie van de ziekte te evalueren en om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe genen / cel / farmacologische interventies te bepalen. Hier presenteren we twee methodes om zowel de contractiele en passieve mechanische eigenschappen van de m. extensor digitorum longus (EDL) spier en de contractiele eigenschappen van de tibialis anterior (TA) spier te evalueren.
In dit protocol hebben we geïllustreerd fysiologische assays voor het meten van de contractiele eigenschappen en passieve EDL de spier en de contractiele eigenschappen van de spier TA. Een belangrijk punt van zorg in de spier fysiologie studies is de zuurstofvoorziening van de doelspier. Voor grote spieren (zoals TA spier), wordt het in situ benadering voorkeur omdat zuurstofdiffusie uit buffer Ringer's kan het midden van de spier niet bereiken in een in vitro assay. In situ aanpak niet normale bloedtoevoer en hypoxie-geassocieerde verstoren kunstmatige effecten worden vermeden. De EDL spier is een van de meest gebruikte spier in fysiologie studie. Voldoende zuurstof van de gehele spier kan worden bereikt in een in vitro systeem vanwege de kleine grootte van de spier. Verder het in vitro systeem biedt een gesloten milieu de concentraties van ionen (Ca 2 +, Na + en K +) en chemisch manipulerencals (ATP en glucose) die nodig zijn voor een optimale spierkracht generatie. Dit biedt een geweldige kans om het effect van deze variabelen op kracht productie te bestuderen.
Nauwkeurige meting van de contractiele en passieve eigenschappen van het ledemaat spier is essentieel voor de skeletspier functie te bestuderen. Kenmerkende veranderingen van deze eigenschappen worden vaak beschouwd als de kenmerken van verschillende spierziekten. Veranderingen in deze parameters zijn belangrijk indicatoren te bepalen of een experimentele therapie effectief is of niet.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AR-49419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), en NIH opleiding subsidie T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.