Changements dans les membres musculaires contractiles et passive propriétés mécaniques sont d'importants biomarqueurs pour les maladies musculaires. Ce manuscrit décrit tests physiologiques pour mesurer ces propriétés dans l'extenseur commun des orteils murin et jambier muscles antérieurs.
Les mouvements du corps sont principalement fournis par la fonction mécanique du muscle squelettique. Muscle squelettique est composé de faisceaux de fibres musculaires de nombreux qui sont gainées par voie intramusculaire tissus conjonctifs. Chaque myofibrille contient plusieurs myofibrilles qui s'exécutent longitudinalement le long de la longueur de la fibre musculaire. Myofibrilles sont l'appareil contractile du muscle et ils sont composés d'unités répétées contractiles appelées sarcomères. Une unité sarcomère contient des filaments d'actine et de la myosine qui sont espacées par des disques à Z et de protéine titine. Fonction mécanique du muscle squelettique est définie par les propriétés contractiles du muscle et passive. Les propriétés contractiles sont utilisées pour caractériser la valeur de la force générée lors de la contraction musculaire, le temps de génération de force et de temps de relaxation musculaire. Tout facteur qui affecte la contraction musculaire (tels que l'interaction entre les filaments d'actine et de myosine, l'homéostasie du calcium, rapport ATP / ADP, etc) influe sur la prope contractileles parties prenantes. Les propriétés passives désignent les propriétés élastiques et visqueuses (rigidité et la viscosité) du muscle en l'absence de contraction. Ces propriétés sont déterminées par la extracellulaire et les composants intracellulaires structurelles (comme titine) et les tissus conjonctifs (collagène principalement) 1-2. Les propriétés contractiles et passive sont deux aspects inséparables de la fonction musculaire. Par exemple, flexion du coude est réalisé par contraction de muscles dans la région antérieure de la partie supérieure du bras et étirement passif des muscles de la loge postérieure de la partie supérieure du bras. Pour vraiment comprendre la fonction musculaire, les deux propriétés contractiles et passive doit être étudiée.
Les propriétés contractiles et / ou passive mécaniques du muscle sont souvent compromis dans les maladies musculaires. Un bon exemple est la myopathie de Duchenne (DMD), une maladie du dépérissement musculaire sévère causée par une carence en dystrophine 3. La dystrophine est une prote du cytosqueletteà qui stabilise la membrane des cellules musculaires (sarcolemme) pendant 4 contraction musculaire. En l'absence de dystrophine, le sarcolemme est endommagé par la force de cisaillement générée lors de la transmission de force. Cette membrane déchirer déclenche une réaction en chaîne qui conduit à la mort cellulaire musculaire et la perte de la machinerie contractile. En conséquence, la force musculaire est réduite et fibres musculaires mortes sont remplacées par des tissus fibreux 5. Ce changement augmente tard 6 raideur musculaire. La mesure précise de ces changements fournit un guide important pour évaluer la progression de la maladie et de déterminer l'efficacité thérapeutique du nouveau gène / cellule / interventions pharmacologiques. Ici, nous présentons deux méthodes pour évaluer les propriétés contractiles et passive mécaniques du muscle long extenseur des orteils (EDL) muscle et les propriétés contractiles du muscle tibial antérieur (TA) du muscle.
Dans ce protocole, nous avons illustré tests physiologiques pour mesurer les propriétés contractiles et passive du muscle EDL et les propriétés contractiles du muscle TA. Une préoccupation majeure dans les études de physiologie du muscle est l'oxygénation du muscle cible. Pour les grands muscles (comme le muscle TA), l'approche in situ est préférée parce que la diffusion de l'oxygène à partir du tampon de Ringer peut pas atteindre le centre du muscle dans un test in vitro. Dans l'approche in situ ne perturbe pas l'approvisionnement normal du sang et de l'hypoxie associée effets artificiels sont évités. L'EDL est l'un des muscles les plus couramment utilisés dans l'étude de la physiologie. Une oxygénation adéquate de l'ensemble du muscle peut être obtenue dans un système in vitro en raison de la petite taille du muscle. En outre, le système in vitro fournit un environnement clos à manipuler les concentrations d'ions (Ca 2 +, Na + et K +) et chimicochimiques (ATP et glucose) qui sont nécessaires pour la génération de la force musculaire optimale. Ce système offre une excellente occasion d'étudier l'effet de ces variables sur la production de force.
La mesure précise des propriétés contractiles et passive du muscle membres est essentielle pour étudier la fonction des muscles squelettiques. Changements caractéristiques de ces propriétés sont souvent considérés comme les maîtres mots de maladies musculaires différents. Les variations de ces paramètres sont également des indicateurs importants pour déterminer si un traitement expérimental est efficace ou non.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AR-49 419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), et les NIH bourse de formation T90DK70105 (CH).
Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.