Tüm deneyler hayvan bakımı ve kullanımı için Ottawa düzenlemeler Üniversitesi'ne göre ele alınmıştır. Protokol genel bir bakış için Tablo 1'e bakınız. 1. İzolasyon Başlamadan Önce Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: % 0.2 collagenase tip DMEM I (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı, 110 mg / ml sodyum piruvat, yüksek glikoz, L-glutamin). İki EDL kasları DMEM% 0.2 Collagenease 2 ml hazırlamak için. 0.22 um filtre içinden çözelti filtre. 37 prewarm izole edilmesinden önce 10 dk ° C su banyosu içinde. Seyreltilmemiş kollajenaz ilave alikotları daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C de donduruldu edilebilir. Not: prosedürünün tüm boyunca sodyum piruvat ile DMEM kullanın. Elyaf sodyum pirüvat içermeyen ortamda hayatta yoktur. Yıkama medya (tüm yıkar gerçekleştirmek için kullanın). % 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. 0 süzülürKullanımdan önce 22'lik um bir filtreden. Myofiber kültür ortamı. % 20 FCS,% 1 tavuk embriyo özü ve% 1 penisilin / streptomisin ile DMEM, Supplement. Kullanmadan önce filtre 0.22 mikron süzülür. Kaplamalı yemekleri Matrigel. Uzun süre için kültür elyaf için, kaplama substrat olarak Matrigel kullanmanızı öneririz. Matrigel kaplı yemekleri hazırlamak için, 4 ° C gecede Matrigel bir kısım Çözülme. Gün sonra, DMEM Matrigel 01:10 sulandırmak. Her zaman 4 ° C Matrigel tutun ve bu düzensiz kaplama sonuçlanan Matrigel çözüm içindeki mikroskobik kristalleri oluşturmak gibi ani sıcaklık değişikliklerinden kaçının. Yer bulaşık buz üzerine kaplanmıştır gerekir. Yüzey kaplamak için yeterli hacmi ile kaplayın yemekler. Bunun 1 dakika bekletin. Tamamen artık Matrigel çıkarın. Kullanımdan önce ya da gece boyunca en azından 3 saat için 37 ° C 'de bulaşık kuruması beklenir. Not: 4 & de saklandığında seyreltilmiş Matrigel hacimde kaplama amacıyla birden çok kez tekrar kullanılabilirg; C. Son olarak,% 70 etanol ile mikroskop istasyonu ve diseksiyon araçları temizlemek için emin olun. : İki EDL izolasyonların (bir fare) aşağıdaki gibi beş plastik petri (60 * 15mm) hazırlamak için Izolasyonu için dört yemekleri (kas disosiyasyon için 1, seri yıkama için 3). Tüm yemekler plastik takılarak gelen myofibers önlemek için at serumu (HS) ile kaplanmış olmalıdır. Ceket için, her yemeğin, girdap içine at serumu olarak pipetle 3 ml hatta kaplama sağlamak için, at serumu çıkarmak ve en az 30 dakika süreyle çanak kurumaya bırakın. Her çanak DMEM 4 ml ekleyin. Kullanımdan önce bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de bulaşık tutun. Not: Steril devam edersem At serumu, birden çok kez yeniden kullanılabilir. Alternatif olarak, DMEM içinde% 10 HS içindeki bir çözeltisine kat bulaşık için kullanılabilir. Bütün protokol boyunca HS kaplı yemekleri kullanın ve yüzen koşullar olduğunda kültür myofibers. Bir yemeğin izolasyon sonra kültür myofibers için kullanılır. Alternative çanak boyutları veya biçimleri alt-uygulamalara bağlı olarak myofibers nihai kültür için de kullanılabilir. Ancak, biz 60 * 15mm daha büyük çanak boyutları önermiyoruz. Hiper daralma meydana gelmeden önce Myofibers artık fazla 96 saat süreyle askıya saklanabilir. Uzun kültürü zamanlar için, biz Matrigel kaplı yemekleri veya plakaları kullanmanızı öneririz. Myofiber manipülasyon kas işleme ve bir küçük kalibreli pipet için büyük bir delik pipet: bir fiber izolasyon (2 EDL) için, iki steril Pasteur pipetler hazırlamak. İstenilen boy ve pipet kenarları düzeltmek için ısı cilası her cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın. Alev kullanılarak, dar çaplı bir pipet eğri ucu. Bu tek elyaf işleme yardımcı olacaktır. Sterilize etmek Alev. Kullanmadan önce HS ile kaplayın Her pipet. 2. Muscle Diseksiyon ve Sindirim Rosa26TdTomato (; Bu deneylerin amacı, 8 haftalık SV129, Pax7 CreER Cklr içinPax7Cre-TdTomato) ve Myf5-Cre; Rosa26YFP kullanılmıştır. % 70 etanol ile arka bacaklarda püskürtün. İşlem sırasında arka bacak daha iyi kavramak için bir destek kuruluna hayvan (yüz yukarı) Pin. Makas yardımı ile, bacak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş ve altta yatan kas maruz kalmaktadır. Cildin yanı sıra herhangi bir saç veya kürk (Şekil 1A) sökün. Ince bir makas ile, altta yatan kasları zarar vermeden ince fasya kesti. Görme EDL yerelleştirilmesine. EDS, sadece tibialis anterior (TA) kas altında arka bacak ön bölme bulunmaktadır. Iki forseps yardımıyla, distal tendon maruz. Keskin Cohann-Vannas yay makas ile distal tendon (TA ve EDL hem) kesin. Forseps yardımıyla kendi tendon TA ve EDL kasları hem tutun ve ince proksimal sonuna doğru kasları yukarı çekin. Bu noktada açıkça görmek mümkün olmalıdırsadece TA kas altında EDL kasının. Şimdi, zıt yönlerde (Şekil 1B) iki tendon çekerek TA kas EDS ayırır. Bu myofibers zarar verecektir Bu işlem gerçekleştirilirken EDL kas germe kaçının. EDS tendonu Açığa. Daha proksimal tendon görselleştirmek için bu ta kas kaldırmak için bu noktada yardımcı olabilir. Ayrıca diz çevresindeki bazı bağ dokusu (Şekil 1C) kesmek için yardımcı olabilir. Proksimal tendon kesin ve hafifçe EDL (Şekil 1D) çıkarın. Onun tendonlar aracılığıyla kas tutarak, önceden hazırlanmış kollajenaz çözüm 2 ml aktarın. Bir su banyosunda 37 ° C'de inkübe edin. Not: başarılı bir şekilde elyaf izolasyon için, bu myofiber bütünlüğünün korunmasını sağlar, böylece tendondan tendona EDS izole etmek için önemlidir. 2,3-2,9 adımları diseksiyon mikroskop altında yapılabilir. Alternatif olarak, bir MAGN kullanımıcam ifying da kasların daha iyi bir görünüm için yardımcı olabilir. İkinci EDL yalıtmak için 2,3-2,9 adımları tekrarlayın. Aynı tüp içinde ikinci EDS aktarın. Düzensiz sindirim önlemek için, ikinci EDL izolasyonu ilk sonra en fazla 5 dk tamamlanması gerekmektedir. Not 1: İnkübasyon süresi kollajenaz aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Uzun veya kısa inkübasyon büyüklüğü, yaş ve / veya kas durum (ör. fibrotik kasları uzun sindirim süresi gerekir) bağlı olarak gerekli olabilir. Not 2: kas sindirim süresi boyunca, sakinleştikten koşullarda ajitasyon uydu hücrelerin davranışını inceleyen uydu hücreleri 10 aktive olabilir varsa. Sindirim süresi boyunca, düzenli olarak aşırı sindirim önlemek için kas kontrol edin. Kasları gevşetmek başlar ve myofibers görünür olduğunda sindirimi durdurur. Sindirim durdurmak için, dikkatli DMEM 4 ml (dissociati ile önceden ısıtılmış Petri kabı hem kas transferiyemeğin üzerine). Bu işlemi gerçekleştirmek için büyük Çapla pipet kullanın. Not: hiper sözleşmeli myofibers üzerindeki izolasyonun bu kaçınılmaz sonuç olarak kas overdigestion kaçının. 3. Tek Myofiber Ayrışma ve Kültür Myofibers serbest bırakmak için, lifler doğal serbest bırakılması başlayana kadar sıcak ortamı ile kas temizlemek için büyük kalibreli cam pipet kullanın. Bu kaçınılmaz zararlı lifler neden olacağı kas çiğnemek etmeyin. Bu ve bir diseksiyon mikroskobu altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin. İstediğiniz numaraya ulaşana kadar myofibers bırakmadan devam edin. Çanak fazla 10 dakika süreyle oda sıcaklığında gerekiyorsa, 37, 5 dakika (en az) inkübasyon ° C,% 5 CO2 orta yeniden denge sağlaması için izin verir. Not: orta uzun bir süre fizyolojik altındaki sıcaklıklarda (37 ° C) ulaşırsa myofibers ölecek. Küçük kalibreli pipet, transfe kullanmar yeni bir önceden ısıtılmış yemek (üç ardışık yıkama ilk) tek myofibers yaşıyor. Yerine tümünü bir seferde myofibers toplu aktarımı tek tek her myofiber taşıyınız. Gerekirse, 37 ° C'de inkübe, orta yeniden dengelenmesi için 10-15 dakika için% 5 CO2. 2 kez daha için adım 3.3 tekrarlayın veya tüm ölü myofibers ve enkaz kaldırılıncaya kadar. Biz uygun temiz-up için en az üç ardışık yıkama önerilir. Not: Kısa ve hiper mikroskop ışık altında sözleşmeli olarak ölü myofibers görünecektir. 37 tek myofibers inkübe ° C, daha önce kültür ortamı için geçiş için en az bir saat boyunca geçen yıkama bulaşık (sadece DMEM) içinde% 5 CO2. Bu myofibers serum yokluğunda in vitro koşullarında ayarlamak için olanak sağlar. Serum zengin orta lif daralma arttırmaktadır myofibers bu acil kültürü bulundu. Bir saat sonra, yeni bir önceden ısıtılmış çanak ya da uygun bir kültür biçimine myofibers aktarmakdownstream uygulamaya bağlı. Yüksek serum ortamında kültive lifler uydu hücre aktivasyonuna izin vermektir. Alternatif olarak, serum ya da tavuk embriyo özü farklı konsantrasyonları da kullanılabilir. Her gün orta değiştirin. 4. Mansap Uygulamaları Immün. Canlı myofibers izolasyon sırasında herhangi bir zaman noktasında sabit ve lekeli olabilir. Immunofluorescence kayan alt tabaka ve ikisi de ekli myofibers üzerinde gerçekleştirilebilir. Kayan myofibers boyama, başka bir çözüm myofibers aktarmak için küçük bir delik cam pipet kullanın. Alternatif olarak, tüm işlem boyunca aynı kuyuda myofibers tutmak ve bir cam pipet kullanarak çözümler eklemek / çıkarmak mümkündür. Bu yanı myofibers çıkarılması neden olacak gibi standart aspirasyon kaçının. Kısaca, tamamen kültür ortamı çıkarın; 5 dakika önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltme myofibers. Yaygın PBS birkaç kez yıkayın. InkübasyonPBS veya diğer standart soğutma çözümleri% 1 glisin te myofibers PFA plan boyama en aza indirmek için. Eğer gerekirse,% 0,1 Triton PBS içinde 5 dakika yıkama ve ardından 10 dakika boyunca PBS içerisinde X-100. Myofibers geçirgen 1 saat oda sıcaklığında ya da tercihan bir gece boyunca 4 ° C'de için blokaj çözeltisi içinde elyaflar (% 10 at serumu,% 0.1 Triton X-100,% 1 NaN) inkübe Alternatif çözümler engelleme ilgili antikor bağlı olarak kullanılabilir. 5 dakika boyunca PBS içinde bir kere yıkayın. 4 ° C'de 1 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca bloke etme çözeltisi ile seyreltilir uygun birincil antikor ile inkübe Bağlanmamış antikor kaldırmak için PBS içinde yıkama başına 5 dk lifler 3 kere yıkayın. Oda sıcaklığında 45 dakika, 1 saat için uygun ikincil antikor ile inkübe edin. PBS içinde yıkama başına 5 dk az 3 kere yıkayın. 1 mg / ml DAPI ile çekirdekler Counterstain. Yüzen elyaf boyama varsa, mikroskopi için uygun bir cam slayt her lif transfer. PBS veya orta herhangi bir aşırı çıkarın. Medi montaj Uygulaum ve sonra lamel ekleyin. Bir floresan mikroskop altında myofibers görselleştirmek için devam edin. EDL myofibers üzerine temsili immünofloresan için Şekil 4'e bakın. Güçlü bir fiksatif kullanan alternatif boyama prosedürleri Verma, M. et al. 11 ve Wosniak, AC ve ark. 12'de tarif edilmektedir. Oligonükleotid ya da plazmid geçici transfeksiyon. Canlı myofibers özgü gen / ilgi s plazmid ya da siRNA ile transfekte edilebilir. SiRNA kullanırken, çift transfeksiyon verimli gen demonte için tavsiye edilir. Bu izolasyon itibaren 8 saat sonra, ilk transfeksiyon icra öneriyoruz. Transfeksiyon sonra altı saat, taze ortam ile değiştirin. SiRNA transfeksiyon için, 50 nM bir nihai konsantrasyon kullanılarak başlangıç göstermektedir. Gen ekspresyonu knockdown RNA ekstraksiyon veya tercihen immün analiz edilebilir. Viral enfeksiyon. Canlı myofibers enfeksiyonu mümkün olmakla beraber hücre sıklığıölüm oligo transfeksiyon ve enfeksiyon verim ile daha yüksek kas koşullar ve yaşa bağlı olarak değişken olabilir. Örneğin, sağlam bir yetişkin kas myofibers ana enfeksiyon, 13, 14 karşı koruyucu bir bariyer sağlamak için gösterilmiştir bazal laminanın varlığı nedeniyle viral enfeksiyon için, özellikle duyarlı olmayan vardır. Onlar hareketsiz (non mitotik) hücreleri enfekte edebilir çünkü lentiviral vektörler retroviral vektörler tercih edilir. Viral enfeksiyon için bir Matrigel kaplı çanak veya plaka ve myofibers ilk 24 saat için ortam koşullarına uyum izin kültürün lifleri tavsiye edilir. Görüntüleme Canlı. Myofibers görüntülenmesi, özellikle zaman alıcı ve bir 37 ° C,% 5 CO2 bölme ile donatılmış bir mikroskop gerektirmektedir canlı. Tek bir uydu hücrelerin davranışını değerlendirirken zaman yararlıdır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışma, uydu hücre heterojenitesini keşif için etkili olmuştur ve onların Beha çalışmalifleri üzerine vior (15 ve 16).