العزلة وثقافة myofibers هو معيار الذهب<em> في المختبر</em> نظام لدراسة الانتقال من الخلايا الأقمار الصناعية من خلال التنشيط، السكون والتمايز. الأهم من ذلك أن الثقافة ليف عضلي واحد يحافظ على نظام الجمعيات الخلية ليف عضلي / الجذعية، والذي هو عنصر أساسي من عناصر الخلية الجذعية المتخصصة العضلات.
يتم تنفيذ تجديد العضلات في البالغين من الخلايا الجذعية المقيمين تسمى الخلايا الأقمار الصناعية. وتعرف الخلايا الأقمار الصناعية من خلال موقفهم الصفيحة القاعدية بين وغمد الليف العضلي كل ليف عضلي. المعرفة الحالية من سلوكهم يعتمد بشكل كبير على استخدام بروتوكول ليف عضلي العزلة واحد. في عام 1985، وصف بيشوف بروتوكول لعزل الألياف الحية واحدة من العضلة القابضة لأصابع القصيرة (FDB) من الفئران الكبار بهدف إنشاء نظام في المختبر حيث يتم الحفاظ على الرابطة الفعلية بين ليف عضلي والخلايا الجذعية لها 1. في عام 1995، Rosenblattmodified بروتوكول بيشوف يتم التقاطها منفردة بحيث myofibers والتعامل معها بشكل منفصل بعد الهضم كولاجيناز بدلا من العزلة بالترسيب الجاذبية 2، 3. منذ ذلك الحين روزنبلات أو بروتوكول بيشوف تكييفها لمختلف العضلات أو السن أو الظروف 3-6. ليف عضلي واحد من العزلة التقنية لا غنى عنهبسبب مزاياه الفريدة الأداة. الأولى، في واحدة بروتوكول ليف عضلي، يتم الاحتفاظ الخلايا الأقمار الصناعية الصفيحة القاعدية تحت. هذه هي ميزة فريدة من البروتوكول وغيرها من التقنيات مثل الإسفار خلية المنشط يتطلب الفرز الكيميائية والميكانيكية الأنسجة التفكك 7. على الرغم من أن نظام الاستزراع ليف عضلي يمكن أن يكون بديلا للفي الدراسات المجراة، فإنه لا توفر منصة ممتازة لمعالجة الخصائص البيولوجية ذات الصلة للخلايا الجذعية العضلية. يمكن تربيتها في ظروف واحدة myofibers الطلاء القياسية أو في ظروف متغيرة. تتعرض الخلايا الفضائية على myofibers عائمة للنفوذ تكاد تنعدم أخرى من البيئة ليف عضلي. وقد ثبت صلابة الركيزة وتلبيس للتأثير على قدرة الخلايا الأقمار الصناعية "لتجديد العضلات 8 و 9 حتى تكون قادرة على السيطرة على كل هذه العوامل بشكل مستقل يتيح التمييز بين مكانة التي تعتمد على ومستقلة الردود. تركيزات مختلفة من المصل لديككما تبين أن يكون لها تأثير على عملية الانتقال من السكون إلى تفعيل. للحفاظ على الدولة سكون من الخلايا التابعة لها يرتبط بها، ينبغي أن تبقى ألياف منخفضة في المتوسط المصل 1-3. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة الجينات المسؤولة في الدولة السكون. في المتوسط الغنية المصل والخلايا الأقمار الصناعية تفعيل بسرعة، تتكاثر، والهجرة التفريق، ومحاكاة وبالتالي في عملية التجدد فيفو 1-3. ويمكن استخدام هذا النظام لأداء مجموعة متنوعة من المقايسات مثل اختبار مثبطات الكيميائية؛ التعبير عن الجينات خارج الرحم عن طريق التسليم الفيروس؛ الجينات مقرها قليل النوكليوتيد تدق إلى أسفل أو التصوير الحي. هذا المقال يصف الفيديو البروتوكول المستخدم حاليا في مختبرنا لعزل myofibers واحد من أصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات من الفئران البالغة (6-8 أسابيع من العمر).
عزلة وثقافة واحدة من العضلات myofibers سليمة توفر ممتازة في نموذج المختبر لدراسة عملية تجديد العضلات. ومن المزايا الفريدة لهذا النظام هو الحفاظ على خلايا القمر الصناعي في بيئتهم الفسيولوجية الصفيحة القاعدية تحت. والأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في تصرفات الخلايا الجذعية العضلية في كل من السكون والدول المنشط. على مدى السنوات ال 20 الماضية، قدمت منظومة الثقافة ليف عضلي رؤى هادفة في علم الأحياء من السكان الخلية الفضائية فيما يتعلق بكل من المحددات الجوهرية وخارجي. من myofibers الفردية زراعة، وقد عولجت الخلايا الأقمار الصناعية التجانس فيما يتعلق ليف عضلي، ونوع العضلات أو المحتملة التجدد 15. وضع الدراسات باستخدام التصوير الحية من الألياف مثقف واحد يسمح لاكتساب المعلومات الفضائية على خلية نمط الهجرة 16. الحصول على البيانات الكمية هيممكن يسوتو. على الرغم من أن تستغرق وقتا طويلا، فإنه يوفر معلومات مهمة بشأن توزيع وقوع أحداث معينة (الخلايا الجذعية غير المتماثلة شعبة، والانتشار والتمايز النسبة، وما إلى ذلك). جنبا إلى جنب مع التطبيقات التي سبق وصفها، أو استخراج البروتين RNA واحد من الألياف الممكن أيضا، على الرغم من عزلة السكان نقية من خلايا الأقمار الصناعية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية أو وسائل أخرى يمكن أن توفر أفضل منصة للتحقيق التغييرات التعبير الجيني البروتين أو على المستوى الجزيئي. في تجربتنا، فإن الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لنجاح العزلة الألياف هو "وتر لوتر" العزلة (الخطوات 2،5 حتي 2،9 في النص البروتوكول). هذا يضمن أنه بعد الهضم العضلات، يتم إطلاق الألياف من مؤسسة كهرباء لبنان بأقل ضرر أو لا وبالتالي زيادة أدائهم في الخطوات التالية.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر سارة ديك لتوفير القراءة النقدية والتعليقات. MAR يحمل كرسي أبحاث كندا في علم الوراثة الجزيئية والباحث هو البحث الدولية للمعهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى MAR من المعاهد الوطنية للصحة، ومعهد هوارد هيوز الطبي، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، ورابطة الضمور العضلي وكرسي أبحاث برنامج كندا.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |