Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de oro<em> In vitro</emSistema> para estudiar la transición de las células satélite a través de quiescencia, la activación y la diferenciación. Es importante destacar que el sistema de miofibra sola cultura conserva la asociación celular miofibra / vástago, que es un componente esencial del nicho de células madre musculares.
La regeneración muscular en el adulto se lleva a cabo por las células madre residentes llamadas células satélite. Las células satélite se definen por su posición entre la lámina basal y el sarcolema de cada miofibras. El conocimiento actual de su comportamiento depende en gran medida el uso del protocolo de aislamiento miofibra sola. En 1985, Bischoff se describe un protocolo para aislar las fibras individuales en vivo desde el flexor digitorum brevis (FDB) de ratas adultas con el objetivo de crear un sistema in vitro en el que se conserva la asociación física entre la miofibra y sus células madre 1. En 1995, el protocolo Rosenblattmodified Bischoff de tal manera que las miofibras se recogió por separado y manipular por separado después de la digestión con colagenasa en lugar de quedar aislada mediante sedimentación por gravedad 2, 3. El Rosenblatt o protocolo Bischoff ha sido adaptado a los diferentes músculos, edad o condiciones 3-6. La técnica miofibra aislamiento individual es indispensableherramienta debido a sus ventajas únicas. En primer lugar, en el único protocolo de miofibras, células satélite se mantiene por debajo de la lámina basal. Esta es una característica única del protocolo como otras técnicas tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia requieren química y tejido disociación mecánica 7. Aunque el sistema de cultivo miofibra no pueden sustituir a los estudios in vivo, sí ofrece una excelente plataforma para abordar importantes propiedades biológicas de las células madre musculares. Miofibras individuales pueden ser cultivadas en condiciones estándar o enchapado en condiciones flotantes. Las células satélite en miofibras flotantes están sometidas a prácticamente ninguna otra influencia que el medio ambiente miofibras. Rigidez sustrato y el revestimiento se ha demostrado que influyen en la capacidad de las células satélite 'para regenerar los músculos 8, 9 así ser capaz de controlar cada uno de estos factores de forma independiente permite la discriminación entre nicho-dependiente y respuestas independientes. Diferentes concentraciones de suero tienenTambién se ha demostrado que tienen un efecto sobre la transición de la inactividad de la activación. Para preservar el estado de quiescencia de sus células satélite asociadas, las fibras se deben mantener en un medio bajo en suero 1-3. Esto es particularmente útil cuando se estudian los genes implicados en el estado de quiescencia. En medio rico suero, las células satélite activar rápidamente, proliferar, migrar y diferenciarse, imitando así el proceso de regeneración in vivo 1-3. El sistema se puede utilizar para realizar una variedad de ensayos tales como el ensayo de inhibidores químicos; expresión ectópica de los genes de virus de entrega; gen oligonucleótido basado knock-down o imágenes en directo. En este artículo se describe el protocolo de vídeo se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para aislar miofibras individuales del extensor digitorum longus (EDL) de ratones adultos (6-8 semanas).
El aislamiento y cultivo de fibras musculares individuales de los músculos intactos proporciona un excelente modelo in vitro para estudiar el proceso de regeneración muscular. Una característica única de este sistema es la preservación de las células satélite en su entorno fisiológico debajo de la lámina basal. Lo más importante, la técnica se puede utilizar para investigar el comportamiento de células estaminales musculares, tanto en reposo y estados activados. En los últimos 20 años, el sistema de cultivo miofibra ha proporcionado una perspectiva interesante sobre la biología de la población de células satélite con respecto a los determinantes intrínsecos y extrínsecos. Por fibras individuales de cultivo, la heterogeneidad celular por satélite con respecto a las miofibras, tipo muscular o potencial regenerativo se ha abordado 15. Elaborar estudios utilizando imágenes en directo de las fibras individuales cultivados permitió la obtención de información en el patrón de migración de las células satélite 16. La adquisición de datos cuantitativos es unalso posible. Aunque mucho tiempo, proporciona información importante sobre la distribución y ocurrencia de eventos específicos (células madre relación asimétrica división, proliferación y diferenciación, etc.) Junto con las aplicaciones descritas anteriormente, la proteína o la extracción de ARN a partir de fibras individuales es también posible, aunque el aislamiento de la población pura de células satélite por FACS u otros medios puede proporcionar una mejor plataforma para investigar los cambios de expresión de proteína o gen a un nivel molecular. En nuestra experiencia, el paso más crítico para el aislamiento de fibra de éxito es el "tendón tendón" aislamiento (pasos 2,5 a 2,9 en el texto del protocolo). Esto garantiza que después de la digestión del músculo, las fibras se liberan de la EDL con un daño mínimo o no aumentando así su rendimiento en los pasos siguientes.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Sarah Dick para proporcionar la lectura crítica y comentarios. MAR titular de la Cátedra de investigación de Canadá en Genética Molecular y es un becario internacional de investigación del Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por becas a MAR de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Médico Howard Hughes, los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Asociación de la Distrofia Muscular y el Programa de Investigación de Canadá Presidencia.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |