L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold standard<em> In vitro</emSistema> per studiare la transizione delle cellule satelliti attraverso quiescenza, l'attivazione e la differenziazione. Soprattutto, l'unico sistema di coltura miofibre preserva la miofibre / stelo associazione cella, che è un componente essenziale della nicchia delle cellule staminali muscolari.
Rigenerazione muscolare nell'adulto viene eseguita da cellule staminali residenti chiamate cellule satelliti. Cellule satellite sono definite dalla loro posizione fra la lamina basale ed il sarcolemma delle miofibre ciascuna. Le attuali conoscenze del loro comportamento si basa molto sull'utilizzo del protocollo unico di isolamento miofibre. Nel 1985, Bischoff descritto un protocollo per isolare singole fibre vivi dalla digitorum Flexor Brevis (FDB) di ratti adulti con l'obiettivo di creare un sistema in vitro in cui è conservata l'associazione fisica tra il miofibre e le cellule staminali 1. Nel 1995, il protocollo Rosenblattmodified Bischoff tale che miofibre vengono prelevati singolarmente e manipolati separatamente dopo digestione con collagenasi invece di essere isolato mediante sedimentazione gravitazionale 2, 3. Il Rosenblatt o Bischoff protocollo è stato poi adattato per diversi muscoli, età o condizioni 3-6. Il singolo tecnica di isolamento miofibre è indispensabilestrumento grazie i suoi vantaggi unici. Primo, nel singolo protocollo miofibre, cellule satelliti sono mantenute sotto la lamina basale. Questa è una caratteristica unica del protocollo, come altre tecniche come la fluorescenza activated cell sorting richiedono chimica e meccanica dei tessuti dissociazione 7. Anche se il sistema di coltura miofibre non possono sostituire gli studi in vivo, esso offre una piattaforma eccellente per affrontare le pertinenti caratteristiche biologiche delle cellule staminali muscolari. Miofibre singoli possono essere coltivate in condizioni standard o placcatura in condizioni galleggianti. Le cellule satellite su miofibre galleggianti sono sottoposti a pratica nessun effetto diverso l'ambiente miofibre. Rigidità substrato e rivestimento hanno dimostrato la capacità di influenzare le cellule satelliti di rigenerarsi muscoli 8, 9 in modo da essere in grado di controllare ciascuno di questi fattori permette indipendentemente discriminazione tra nicchia-dipendente e-indipendenti risposte. Diverse concentrazioni di siero hannoanche dimostrato di avere un effetto sulla transizione dalla quiete per l'attivazione. Per mantenere lo stato di quiescenza delle sue cellule satellitari correlati, le fibre devono essere tenuti in condizioni di scarsa media siero 1-3. Ciò è particolarmente utile quando si studiano i geni coinvolti nello stato di quiescenza. Nel siero terreno ricco, le cellule satellite attivare rapidamente, proliferano, migrano e si differenziano, quindi imitando il processo nel vivo rigenerativo 1-3. Il sistema può essere utilizzato per eseguire una varietà di saggi quali il test di inibitori chimici; espressione ectopica di geni di consegna virus; oligonucleotide gene basata knock-down o imaging vivo. In questo articolo il video descrive il protocollo attualmente in uso nel nostro laboratorio per isolare singole miofibre dal estensore lungo delle dita (EDL) muscolo di topi adulti (6-8 settimane).
L'isolamento e la coltura di singole miofibre di muscoli intatti fornisce un eccellente modello in vitro per studiare il processo di rigenerazione muscolare. Una caratteristica unica di questo sistema è la conservazione di cellule satelliti nel loro ambiente fisiologico sotto la lamina basale. Soprattutto, la tecnica può essere usato per studiare il comportamento delle cellule muscolari staminali sia quiescenza e stati attivati. Negli ultimi 20 anni, il sistema cultura miofibre ha fornito indicazioni significative sulla biologia della popolazione di cellule satellite rispetto ad entrambi determinanti intrinseci ed estrinseci. Da miofibre singoli coltura, eterogeneità cellula satellite rispetto al miofibre, tipo di muscolo o potenziale rigenerativo è stato affrontato 15. Elaborare studi che utilizzano l'imaging dal vivo di singole fibre coltivate consentiti per ottenere le informazioni sul modello di migrazione delle cellule satellite 16. L'acquisizione dei dati quantitativi èLSO possibile. Anche se richiede tempo, fornisce informazioni significative sulla distribuzione e verificarsi di eventi specifici (cellule staminali asimmetrico rapporto di divisione, proliferazione e differenziazione, ecc). Insieme con applicazioni precedentemente descritte, proteina o l'estrazione di RNA da singole fibre è anche possibile, sebbene isolamento di popolazione pura di cellule satelliti da FACS o altri mezzi possono fornire una migliore piattaforma per analizzare le variazioni di espressione della proteina o del gene a livello molecolare. Nella nostra esperienza, la fase più critica per l'isolamento in fibra di successo è il "tendine a tendine" isolamento (passi 2,5-2,9 nel testo del protocollo). Questo garantisce che, dopo la digestione muscolari, fibre vengono rilasciati dalla EDL con minimo danno o no aumentando così le loro prestazioni nei seguenti passi.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Sarah Dick per la fornitura di lettura critica e commenti. MAR detiene il Canada Research Chair in Genetica Molecolare ed è un Research Scholar Internazionale del Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni al MAR dal National Institutes of Health, l'Howard Hughes Medical Institute, il Canadian Institutes of Health Research, l'Associazione distrofia muscolare e il programma di ricerca del Canada presidente.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |