1. Picking cloni di espressione di cDNA La libreria di cDNA è fornito come singoli cloni batterici in stock glicerolo in un formato a 96 pozzetti. Utilizzando il comando Rearray nel menu del selettore del CP7200 Norgen, scegliere cloni batterici dal piatto di origine e inoculare in 1,5 ml LB / amp in un 96-Deepwell (1 ml bene) piastra. Sigillare le piastre Deepwell con un gas-permeabile tenuta e incubare una notte a 37 ° C in un agitatore. 2. Preparazione di cDNA library espressioni Far girare le piastre Deepwell contenenti i batteri a 2000 rpm per 20 minuti usando adattatori piastra in una centrifuga da tavolo. Aspirare supporti dai pozzi, lasciando intatto il pellet batterico. Configurare il ponte della workstation automazione Lab come mostrato in Figura 2. Soluzioni per la preparazione plasmide sono distribuiti in trogoli 1-5 e la piastra Deepwell è posto sul ponte. Un trogolo multipozzetto con soluzione di eluizioneè posto adiacente alla piastra Deepwell. Suggerimenti sono caricati nei rack per puntali. Montare il collettore del vuoto. La piastra plasmide legame è collocato all'interno del collettore e la piastra plasmide filtro è posto sulla parte superiore del collettore. Risospendere pellet con 250 ul di soluzione 1 (tampone di risospensione) pipettando su e giù. Lyse i batteri con l'aggiunta di 250 ul di soluzione 2 (tampone di lisi). La piastrina è sigillata e invertito per consentire una miscelazione completa. Start 2 timer min. Aggiungere 350 ul di soluzione 3 (tampone di neutralizzazione). Sigillare la piastra e capovolgere 3 volte. Trasferire i lisati batterici alle piastre filtranti plasmide. Applicare il vuoto per 5 min. Rimuovere la piastra filtrante e posizionare la piastra di attacco sulla sommità del collettore. Applicare il vuoto per 1 min. Aggiungere 500 ml di lavaggio supplementare (AW) buffer. Applicare il vuoto per 2 min. Aggiungere 900 ml di soluzione tampone di lavaggio 4. Applicare il vuoto per 2 min. Ripetere step 2.14. Applicare il vuoto per altri 15 min. Posizionare collezione di piatti del DNA all'interno del collettore. Aggiungere 100 pl di tampone di eluizione alla piastra di attacco e incubare per 2 min. Vuoto per 10 min. Rimuovere la piastra di raccolta e concentrazione di DNA misura utilizzando il Nanodrop 8000. Tipicamente una resa di ~ 100 ng / mL può essere previsto con questo metodo. 3. Semina cellulare HEK293 cellule vengono tripsinizzate e contate. 2 x 10 4 cellule vengono erogate in ciascun pozzetto di una Viewplate PerkinElmer usando il ThermoFisher 96-well multidrop. Le cellule sono incubate per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. 4. Transfection Preparare una miscela di 100 ng GFP-Grb2 DNA plasmidico con 100 ng di cDNA in 25 pl terreno privo di siero per pozzetto a fondo rotondo a 96 pozzetti. Aggiungere 25 pl senza siero supporti contenenti 0,5 Transfectin microlitri per pozzetto. Mescolare e avviare il timer for 30 min. Trasferire 50 microlitri di cDNA / Transfectin mix di cellule utilizzando un metodo delicato di erogazione. In alternativa, la miscela di trasfezione può essere erogato in piastre prima e poi le cellule aggiunto il top (trasfezione inverso). Incubare le cellule notte a 37 ° C e 5% di CO 2. 5. Acquisizione di immagini Avviare il software Opera. Un'istantanea schermata della procedura di configurazione è mostrata in Figura 3. Selezionare la scheda "Configurazione" e selezionare 20x obiettivo e il tipo di piastra corretto. Assicurarsi che "collare" è impostato al valore corretto per l'obiettivo di consentire la messa a fuoco con diversi tipi di lastre. Selezionare la scheda "Microscopio". Definire l'esposizione 1 come FITC (488 laser) e l'esposizione ai raggi UV 2 come (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l'esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l'esposizione 1 e 40 msec per l'esposizione 2. Selezionare la scheda "Microscopio". Definire eXposure 1 come FITC (488 laser) e 2 come esposizione UV (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l'esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l'esposizione 1 e 40 msec per l'esposizione 2. Selezionare l'esposizione 1. Impostare lo stato attivo altezza a 0 micron. Selezionare "Focus". Una volta concentrata, esporre la fotocamera 1. Regolare l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e clicca su "altezza Take". Modificare i tempi di esposizione e la potenza del laser per dare un'intensità massima di pixel di circa 3000. Salvare i parametri di esposizione. Ripetere l'operazione per l'esposizione 2. Selezionare "Definizione Experiment" tab. Creare layout e sublayout. Trascinare e rilasciare il relativo schema, l'esposizione, immagine di riferimento, il file skewcrop e sublayout. Salva esperimento. Selezionare "Automatico Experiment" scheda e acquisire immagini. 6. Image Analysis (Basato sulla versione ImageJ 1.46h.) Convertire il PerkinElmer proprietario. File flessibile per Tagged Image. Tif file utilizzando ilFlex2Volocity Acapella script. Importare immagini in ImageJ come una sequenza di immagini, risultante in una pila. Convertire la pila in un canale 2 HyperStack selezionando l'immagine / HyperStack / stack di voce di menu HyperStack. Il numero di fette deve essere impostato a metà della pila importato. Duplicate il canale con il GFP Immagine / comando Duplica: selezionare la casella di controllo e specificare Duplica HyperStack Canali: 1-1. Appresso utilizzare lo stack duplicato. Selezionare Processo / Migliora contrasto con 0,01% dei pixel saturi, con istogramma stack e convertire a 8 bit con Image/Type/8-bit. Definire a 15 segmentazione raggio locale pixel utilizzando l'algoritmo adattivo Bernsen con soglia di contrasto (parametro 1) q = 30. Spunta gli oggetti bianchi su sfondo nero nella casella di controllo Immagine / Regola / Auto menù soglia locale. Controllo di qualità Segmentazione: generare segmentato overlay contorno dell'oggetto sulle immagini originali. Featuri di estrazione analizzando le particelle: area di misurazione, media e l'intensità totale di ogni organello. Salva file dei risultati. Aprire il risultato caratteristiche file in R e generare un istogramma. 7. Risultati rappresentativi In condizioni normali Grb2 è localizzato durante l'intera cella. Dopo stimolazione di un recettore del fattore di crescita si trasloca alla membrana plasmatica e viene successivamente internalizzato in endosomi come mostrato in Figura 4. L'espressione di un recettore di superficie cellulare capace di Grb2 legame è sufficiente per indurre questa traslocazione. In un esperimento tipico di screening, nessun cambiamento in GFP-Grb2 localizzazione viene osservata. Tuttavia, quando una proteina che è espressa Grb2 reclute ad un sub-cellulare sito, vi è un cambiamento di localizzazione che può essere facilmente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Ad esempio, l'espressione dei risultati EGFR rilocalizzazione della GFP-Grb2 a endosome strutture simili (Figura4). Così, applicando un genoma biblioteca, si può prevedere che nuovi Grb2 proteine leganti di superficie cellulare possono essere identificati. Questo metodo non è limitata alla rilevazione di proteine di superficie cellulare. Per esempio, Dynamin2 induce un cambiamento nella localizzazione sub-cellulare di GFP-Grb2 visualizzazione endosomi-like reclutamento (Figura 5). Dynamin2 lega al C-terminale del dominio SH3 Grb2 ed è coinvolto in endocitosi di questo complesso 9,10. Pertanto, questo approccio consente l'identificazione di complessi proteici generali vincolanti e non è limitata alla individuazione di partner di interazione per il dominio SH2. Diversi tipi di traslocazione può prevedere come la localizzazione alla membrana plasmatica, ad endosomi, altre strutture vescicolari citoplasmatiche o al nucleo. Pertanto, si raccomanda che tutte le immagini siano anche ispezionate dagli occhi. Tuttavia, quando lo screening di grandi insiemi di cDNA un sistema automatizzatoalgoritmo di analisi immagine è più pratico. In questo caso, una combinazione di algoritmi è desiderabile, come il rilevamento punto per identificare endosomi, citoplasma / nucleo rilevazione per identificare algoritmi morfologici nucleari spola e generale per identificare cambiamenti forma cellulari. L'uso di questi metodi di rilevazione differenti fenotipiche è stato discusso in dettaglio altrove 11. Figura 1. Schema generale della sperimentazione. L'esperimento i dettagli di un completo ad alto contenuto di flusso di lavoro di screening a partire con l'amplificazione e la preparazione della libreria di cDNA, trasfezione di vettori di cDNA più costrutti reporter, l'acquisizione di immagini e analisi di immagine utilizzando il software libero e open ImageJ. Figura 2. Configurazione del ponte Tecan. (1) Sulla sinistra, cinque trogoli 100 ml devono essere riempiti con buffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) e A4 (100 ml). A4 Trough dovrà essere riempito volta durante la procedura. (2) Il collettore di vuoto si trova sulla posizione 14 in questo esempio. (3) La piastra Deepwell con pellet batterici si trova in posizione 30, vicino al trogolo tampone di eluizione con 25 ml di tampone di eluizione. (4) punte monouso per la 8 canali testa devono essere caricati nei rack punta sul lato sinistro e suggerimenti per la testa multicanale devono essere compilati sulla posizione 40. Il liquido Tecan FreedomEvo gestore che viene utilizzato in questo esperimento è equipaggiato con 500 siringhe pl. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura3. Automazione di acquisizione dell'immagine sulla LX Opera. A) Selezionare la scheda Configurazione (1). Attivare le linee laser necessari per l'esperimento (2). Selezionare le telecamere per l'acquisizione delle immagini (3). Selezionare il tipo di piastra e lente obiettivo dell'esperimento (4). B) Selezionare la scheda microscopio (1). Definire la sorgente di luce e il tempo di esposizione per esposizione 1 (2,3). Focus su un pozzetto e prendere altezza (4). C) Selezionare la scheda Definizione Experiment (1). Trascinare e rilasciare l'esposizione, skewcrop, di riferimento, il layout e file sublayout (2). Trascinare e rilasciare il file esperimento (3). D) Selezionare Esperimento automatico (1). Trascinare e rilasciare file di esperimento (2). Assegnare codice a barre del caso (3). Avviare l'acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante di avvio (4). Clicca qui per ingrandire la figura . <strong> Figura 4. GFP-Grb2 traslocazione di espressione di cDNA. GFP-GRB2 si trasferisce da una localizzazione citoplasmatica predominante di endosomi strutture simili su sovraespressione di un recettore del fattore di crescita transmembrana e interiorizza successivamente endosomi. A sinistra, le immagini di microscopia COS M6 cellule sono presenti che sono state trasfettate con GFP-Grb2 (in alto) o GFP-Grb2 più EGFR (in basso). La co-espressione dei risultati EGFR nel trasferimento di GFP-Grb2 di endosomi strutture simili. Figura 5. Esempio di cDNA indotta traslocazione di GFP-Grb2. Il Dynamin2 GTPasi, che si occupa di Grb2 endocitosi mediata, trasferisce GFP-Grb2 di endosomi strutture simili (cerchio). In questo esperimento, GFP-Grb2 è stato co-transfettato in cellule con DNM2 HEK293T. Le cellule sono state colorate con Hoechst 33342 dopo 24 ore e le immagini sono state acquisite sul Opera LX. Un campo di vista del (GFP) e il canale verde UV (blu; Hoechst 33342) viene visualizzato.