1. בחירת שיבוטי cDNA Expression ספריית cDNA מסופקת כשיבוטי חיידקים בודדים במניות גליצרול בפורמט 96 היטב. באמצעות פקודת Rearray בתפריט של בורר Norgen CP7200, לאסוף שיבוטי חיידקים מצלחת המקור ולחסן לLB 1.5 מ"ל / מגבר ב96-deepwell (1 מ"ל היטב) צלחת. לאטום את צלחות deepwell עם חותם גז חדיר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס במטרף. 2. הכנת ספריית הביטוי cDNA לסובב את צלחות deepwell המכילות את החיידקים ב2000 סל"ד במשך 20 דקות באמצעות מתאמי צלחת בצנטריפוגה בראש הטבלה. לשאוב תקשורת מהבארות, ומשאיר את גלולת החיידקים ללא פגע. הגדר את הסיפון של תחנת עבודת אוטומצית המעבדה כפי שמוצג באיור 2. פתרונות להכנת פלסמיד מופצים לשקתות 1-5 וצלחת deepwell ממוקמת על הסיפון. שוקת multiwell עם פתרון elutionממוקם בסמוך לצלחת deepwell. טיפים נטענים לתוך מדפי טיפ. הרכב את סעפת הוואקום. הצלחת המחייבת פלסמיד ממוקמת בתוך הסעפת וצלחת מסנן פלסמיד ממוקמת בחלק העליון של הסעפת. Resuspend כדורים עם פתרון 250 μl 1 (חיץ Resuspension) על ידי pipetting למעלה ולמטה. Lyse את החיידקים על ידי תוספת של 250 פתרוני μl 2 (חיץ תמוגה). הצלחת היא חתומה ומתהפכת כדי לאפשר ערבוב מוחלט. הפעלת טיימר 2 דקות. הוסף פתרון μl 350 3 (חיץ Neutralisation). לאטום את הצלחת ולהפוך 3 פעמים. העבר את lysates החיידקים לצלחות סינון פלסמיד. החל ואקום למשך 5 דקות. הסר את מסנן הצלחת ומניח את הצלחת על גבי הכריכה של הסעפת. החל ואקום לדקות 1. הוסף 500 μl של שטיפה נוספת (AW) חיץ. החל ואקום עבור 2 דקות. הוסף 900 μl של פתרון חיץ לשטוף 4. החל ואקום עבור 2 דקות. חזור על זהטפ 2.14. החל ואקום ל15 דקות נוספות. הנח צלחת אוסף דנ"א בתוך הסעפת. הוסף 100 μl של חיץ elution לצלחת המחייבת ודגירה במשך 2 דקות. אבק למשך 10 דקות. הסרת צלחת איסוף וריכוז הדנ"א מידת שימוש Nanodrop 8000. בדרך כלל תשואה של ~ 100 ng / μl ניתן לצפות בשיטה זו. 3. זריעת תאים HEK293 תאים trypsinized ונספרו. 2 10 4 תאי x הם חלקו לכל אחד גם מViewplate PerkinElmer באמצעות ThermoFisher 96-multidrop היטב. תאים מודגרת לילה על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2. 4. Transfection הכן תערובת של דנ"א 100 ng-GFP Grb2 פלסמיד עם 100 ננוגרם של cDNA ב25 בינוני μl סרום נטול כל גם בתחתית צלחת 96-גם עגולה. הוספת 25 תקשורת סרום נטול μl המכילה Transfectin μl 0.5 לטוב. לערבב ולהתחיל טיימר fo30 דקות r. העברת 50 μl תמהיל cDNA / Transfectin לתאים באמצעות שיטה מחלק עדינה. לחלופין, תערובת transfection ניתן לוותר אל תוך צלחות ולאחר מכן תאים נוספים בחלק העליון (transfection ההפוך). דגירת תאי לילה על 37 מעלות צלזיוס וCO 2% 5. 5. יבוא תמונות התחל תוכנת אופרה. תמונת מסך של הגדרת הניסוי מוצגת באיור 3. בחר בכרטיסיית "ההגדרות" ובחר 20x אובייקטיבי וסוג הצלחת הנכונה. ודא "צווארון" מוגדר הערך הנכון במטרה לאפשר להתמקדות בסוגים שונים צלחת. בחר בכרטיסייה "מיקרוסקופ". הגדר חשיפת 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. בחר בכרטיסייה "מיקרוסקופ". הגדרת דוארxposure 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. בחר חשיפה 1. קבע את המוקד לגובה 0 מיקרומטר. בחר "פוקוס". ברגע ממוקד, תחשוף מצלמה 1. התאם את גובה המוקד כדי לייעל את מטוס החשיפה ולחץ על "גובה לקחת". לשנות את זמני החשיפה וכוח הליזר לתת עוצמת פיקסל מקסימלי של ~ 3000. שמור את פרמטרי חשיפה. חזור לחשיפה 2. בחר בכרטיסייה "הגדרת ניסוי". ליצור את הפריסה וsublayout. גרור ושחררת את הפריסה, חשיפה, הפניה לתמונה, קובץ skewcrop הרלוונטי וsublayout. שמור ניסוי. בחר בכרטיסייה "אוטומטית ניסוי" ולרכוש תמונות. 6. ניתוח תמונה (מבוסס על גרסת 1.46h ImageJ.) המרת PerkinElmer הקניינית. קבצים להגמיש לפורמט תמונה שתייג. Tif קובץ באמצעותתסריט Flex2Volocity Acapella. לייבא תמונות בImageJ כרצף תמונות, וכתוצאה מהערימה. המר את הערימה לערוץ 2 hyperstack ידי בחירת התמונה / Hyperstack / סטאק לפריט תפריט Hyperstack. מספר הפרוסות חייב להיות מוגדר למחצית הערימה המיובאת. לשכפל את ערוץ ה-GFP באמצעות תמונה / פקודה כפולה: סמן את תיבת סימון hyperstack הכפולה ולציין ערוצים: 1-1. להלן ישתמש במחסנית הכפולה. בחר תהליכים / ניגודיות שפר עם פיקסלים רוויים 0.01%, באמצעות היסטוגרמה מחסנית ולהמיר 8 ביט עם Image/Type/8-bit. הגדר פילוח 15 פיקסל רדיוס מקומי מסתגל באמצעות אלגוריתם Bernsen עם סף ניגוד (פרמטר 1) ש '= 30. סמן את תיבת סימון האובייקטים הלבנים על רקע שחורה בתפריט הסף המקומי / האוטומטית של תמונה / התאמה. בקרת איכות פילוח: ליצור שכבת קו מתאר אובייקט מפולחת על תמונות המקוריות. Featuמחדש חילוץ על ידי ניתוח חלקיקים: אזור מדידה, אומר ועצמה כוללת של כל אברון. שמירת קבצי תוצאה. פתח את קובץ תוצאת התכונות במחקר וליצור היסטוגרמה. 7. נציג תוצאות בתנאים נורמלים Grb2 הוא מקומי בכל רחבי התא. לאחר הגירוי של הקולטן לגורם צמיחה זה translocates לממברנת הפלזמה וגם הופכים להפנים לתוך endosomes כפי שמוצג באיור 4. הביטוי של הקולטן פני תא מסוגל Grb2 המחייב הוא מספיק כדי לגרום לטרנסלוקציה זו. בניסוי הקרנה טיפוסי, לא חל שינוי בלוקליזציה GFP-Grb2 הוא ציין. עם זאת, כאשר חלבון מתבטא שGrb2 מתגייסים לאתר משנה הסלולר, יש שינוי בלוקליזציה שיכולה להיות בקלות דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, ביטוי של תוצאות EGFR בrelocalization של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (איור4). לפיכך, בעת החלת ספרייה הגנום, ניתן לצפות שחלבונים בתא שטח Grb2 מחייב רומן יכולים להיות מזוהים. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי של חלבונים בתא שטח. לדוגמה, Dynamin2 גורם לשינוי בלוקליזציה משנה הסלולר של ה-GFP-Grb2 הצגת הגיוס endosome דמוי (איור 5). Dynamin2 נקשר לתחום של Grb2 SH3 C-מסוף ומעורב באנדוציטוזה של 9,10 המורכב זו. לפיכך, גישה זו מאפשרת זיהוי של קומפלקסים מחייבים חלבון כלליים ואינו מוגבל לזיהוי של שותפים לאינטראקצית תחום SH2. סוגים שונים של כמה טרנסלוקציה ניתן לצפות כגון לוקליזציה לממברנת הפלזמה, לendosomes, מבנים אחרים cytoplasmic שלפוחי או לגרעין. לכן, מומלץ כי כל התמונות גם נבדקות על ידי עין. עם זאת, כאשר מיון קבוצות גדולות של cDNAs אוטומטיאלגוריתם ניתוח תמונה הוא יותר מעשי. במקרה זה, בשילוב של אלגוריתמים רצוי, כגון זיהוי מקום לזהות זיהוי endosomes, ציטופלסמה / גרעין לזהות אלגוריתמים מורפולוגיים הלוך גרעיניים וכלליים כדי לזהות שינויי צורה סלולריות. השימוש בשיטות זיהוי שונים פנוטיפי אלה נדון בפירוט רב יותר במקום אחר 11. איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. פרטי ניסוי זרימת עבודה גבוהת הקרנת תוכן מלאה החל מההגברה והכנת ספריית cDNA, transfection של וקטורי cDNA תוספת בונת כתב, רכישת תמונה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת IMAGEJ הפתוח ללא תשלום. Figure 2. תצורה של סיפון טקאן. (1) בצד השמאלי, חמש 100 מיליליטר שקתות צריכות להיות מלאה עם חוצצים 1 (40 מ"ל), 2 (40 מ"ל), 3 (50 מ"ל), AW (60 מ"ל) וA4 (100 מ"ל). A4 השוקת יהיה צורך מחדש מולא פעם אחת במהלך ההליך. (2) סעפת הוואקום ממוקמת בעמדה 14 בדוגמה זו. (3) צלחת deepwell עם כדורי חיידקים נמצאת בעמדה 30, ליד שוקת חיץ elution עם חיץ 25 מ"ל elution. (4) טיפים חד פעמים לראש הערוץ 8-צריכים להיות טעונים במדפי טיפ על צד השמאל ועצות לראש רב צריכים להיות מלא בעמדה 40. מטפל נוזל FreedomEvo טקאן המשמש בניסוי זה מצויד עם 500 מזרקי μl. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. דמות3. אוטומצית רכישה של תמונה על אופרת LX. א) בחר בכרטיסיית התצורה (1). הפעל את קווי הליזר הדרושים לניסוי (2). בחר את המצלמות לרכישת תמונה (3). בחר את סוג הצלחת והעדשה אובייקטיבית לניסוי (4). B) בחר בכרטיסיית מיקרוסקופ (1). הגדר את מקור האור וזמן חשיפה לחשיפת 1 (2,3). להתמקד באחד וגם לקחת גובה (4). ג) בחר בכרטיסיית הגדרת הניסוי (1). גרור ושחררת חשיפה, skewcrop, קבצי sublayout (2) התייחסות, ופריסה. גרור ושחררת את קובץ הניסוי (3). ד) בחר ניסוי אוטומטי (1). גרור ושחררת קובץ ניסוי (2). להקצות ברקוד המתאים (3). התחל רכישת תמונה על ידי לחיצה על הכפתור התחל (4). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <strong> איור 4. טרנסלוקציה GFP-Grb2 ידי ביטוי cDNA. מיקומם GFP-Grb2 מלוקליזציה cytoplasmic שלטת למבני endosome דמויים על ביטוי יתר של קולטן גורם גדילת הטרנסממברני ולאחר מכן מפנה לendosomes. בצד השמאל, תמונות מיקרוסקופיה של M6 תאי COS מוצגות שtransfected זמנית עם GFP-Grb2 (למעלה) או GFP-Grb2 תוספת EGFR (למטה). שיתוף ביטוי לתוצאות EGFR בהעתקה של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים. איור 5. דוגמה לטרנסלוקציה cDNA המושרה של GFP-Grb2. GTPase Dynamin2, העוסק באנדוציטוזה Grb2 בתיווך, מיקומם GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (מוקף בעיגול). בניסוי זה, GFP-Grb2 היה שיתוף transfected עם DNM2 לתוך תאי HEK293T. תאים הוכתמו Hoechst 33342 אחרי 24 שעות ותמונות נרכשו על אופra LX. תחום אחד מבט של הערוץ הירוק (GFP) ו UV (כחול; Hoechst 33342) מוצג.