Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt voorspellingen<em> In vivo</em> Eiwitbinding en de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen.
Signaaltransductie door groeifactorreceptoren essentieel is voor cellen proliferatie en differentiatie behouden en heeft strakke controle. Signaaltransductie geïnitieerd door de binding van een ligand aan een externe transmembraan receptor en de activering van stroomafwaartse signalering cascades. Een van de belangrijkste regulator van mitogene signalering is Grb2, een modulair eiwit bestaat uit een interne SH2 (Src homologie 2) domein geflankeerd door twee SH3 domeinen die enzymatische activiteit ontbreekt. Grb2 wordt constitutief geassocieerd met de GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via de N-terminale SH3 domein. De SH2 domein van Grb2 bindt aan groeifactorreceptoren op gefosforyleerde tyrosineresiduen aldus koppeling receptor activatie van de SOS-Ras-MAP kinase signalerende cascade. Daarnaast zijn andere rollen voor Grb2 als positieve of negatieve regulator van signalering en receptor endocytose beschreven. De modulaire samenstelling van Grb2 suggereert dat het kan koppelen aan verschillende receptoren en transduce signalen langs een veelheid van verschillende paden 1-3.
Hier beschreven is een eenvoudige test die microscopie werving van Grb2 bewaakt naar de plasmamembraan. Het is een bewerking van een test waarmee veranderingen in subcellulaire lokalisatie van groen-fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Grb2 in reactie op een stimulus 4-6 meet. Plasmamembraan receptoren die Grb2 zoals geactiveerde Epidermale Groei Factor Receptor binden (EGFR) werven GFP-Grb2 aan het plasmamembraan op cDNA expressie en vervolgens verplaatsen naar endosomale compartimenten in de cel. Ter identificatie in vivo eiwitcomplexen van Grb2 Deze techniek kan worden gebruikt om een genoomwijde high-content scherm gebaseerd op veranderingen in Grb2 subcellulaire lokalisatie voeren. De bereiding van cDNA expressieklonen, transfectie en beeldacquisitie worden hieronder in detail beschreven. Vergeleken met andere genomische methoden voor eiwit interactie te identificeren partners, zoals gist-twee-hybrid, deze techniek kan de visualisatie van eiwitcomplexen in zoogdiercellen de subcellulaire plaats van interactie met gewone microscopie gebaseerde bepaling. Vandaar dat beide kwaliteitskenmerken, zoals patronen van lokalisatie kan worden beoordeeld, en de kwantitatieve sterkte van de interactie.
Expressieklonering is een krachtig hulpmiddel dat gebruikt is in het verleden nieuwe cellulaire componenten zoals virus receptoren en antigenen bloedcel 12 te identificeren. We beschrijven een methode voor de identificatie van nieuwe kandidaat signaaltransductie receptoren die binden aan Grb2 vergemakkelijken.
Er zijn een paar kritische stappen in het protocol.
De Grb2 translocatie assay is gebruikt door andere groepen kleine molecule inhibitoren van EGFR kinase activatie 6 identificeren. In dat geval wordt de EGFR ligand specifiek geactiveerd waardoor werving van Grb2 naar de plasmamembraan. Verstoring van deze interactie kan vervolgens worden onderzocht met kleine moleculen bestaan. Ook kan het mogelijk zijn dat siRNA schermen kunnen worden gebruikt om endogene genen in EGFR-signalering Grb2 of Grb2-bindende groeifactor receptoren zoals c-KIT of erytropoëtinereceptor identificeren. Zo zijn er verschillende mogelijke toepassingen voor deze techniek. Een analoge benadering kan worden toegepast op GFP-gemerkte reporter systemen voor andere adapter moleculen zoals Shc, Gab of IRS.
Een groot voordeel van deze cel-gebaseerde test in zoogdiercellen is dat de identificatie van fysiologisch rel kunnenvante interacties. De assay is een indicatie voor eiwit complexvorming, maar nog belangrijker, de relevante interacties gecontroleerd op de juiste subcellulaire site. In dit verband deze techniek overwint artefacten andere eiwit-eiwit interactie methoden zoals yeast-two-hybrid of in vitro assays. Het moet echter worden opgemerkt, dat de indirecte interacties ook kan resulteren in Grb2 recruitment. Evenzo kan de transcriptionele opregulatie van bindingspartners worden geïnduceerd door cDNA expressie. Het onderscheid tussen deze mogelijkheden, moet het geschikte secundaire assays uitgevoerd om onderscheid te maken tussen directe en indirecte effecten binding.
Kortom, de GFP-adapter molecuul translocatie test belooft een groot potentieel voor genoom-brede screening en drug discovery programma's.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council en de Marie-Curie International Reintegration Grant regeling (tot JKV).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |