يوصف أسلوب الفرز الفائق المحتوى لتحديد مستقبلات عبر الغشاء الرواية يشير المختصة. هذا الأسلوب هو قابل للتشغيل الآلي على نطاق واسع ويسمح التنبؤات حول<em> في الجسم الحي</em> ملزمة البروتين وتوطين الفرعي الخلوية مجمعات البروتين في خلايا الثدييات.
نقل الإشارة من قبل مستقبلات عامل النمو أمر ضروري لخلايا للحفاظ على الانتشار والتمايز ويتطلب رقابة مشددة. يبدأ نقل الإشارة من قبل ملزم ليجند الخارجية إلى مستقبلات عبر الغشاء وتفعيل أجهزة الطرد المركزي يشير المصب. A المنظم الرئيسي للإشارة مولد للتفتل هو Grb2، وهو بروتين وحدات تتألف من المجال الداخلي (SRC التماثل 2) SH2 يحيط بها اثنان SH3 المجالات التي تفتقر النشاط الأنزيمي. ويرتبط جوهري Grb2 مع الابن GTPase-OF-Sevenless (SOS) عبر المجال الخاص به SH3 N-الطرفية. المجال SH2 من Grb2 يربط لمستقبلات عامل النمو في بقايا التيروزين فسفرته اقتران بالتالي تنشيط مستقبلات لسلسلة SOS-MAP-رأس إشارات كيناز. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت الأدوار الأخرى للGrb2 كمنظم الإيجابية أو السلبية لمستقبلات الإشارات والإلتقام. تكوين وحدات من Grb2 يشير إلى أنه يمكن إرساء لمجموعة متنوعة من المستقبلات وtransducه يشير إلى جانب عدد وافر من مسارات مختلفة 1-3.
الموصوفة هنا هو الفحص المجهري بسيطة التي تراقب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. أنها مقتبسة من الفحص الذي يقيس التغيرات في شبه الخلوية توطين الفلورية الخضراء البروتين (GFP)-الموسومة Grb2 ردا على التحفيز 4-6. مستقبلات غشاء البلازما التي تربط Grb2 مثل تنشيط البشرة مستقبلات عوامل النمو (EGFR) تجنيد GFP-Grb2 إلى غشاء البلازما على التعبير [كدنا] والانتقال بعد ذلك إلى حجرات endosomal في الخلية. من أجل تحديد البروتين في الجسم الحي من المجمعات Grb2، يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء الجينوم على نطاق عالية محتوى الشاشة يعتمد على التغيرات في توطين الفرعي الخلوية Grb2. موصوفة إعداد استنساخ [كدنا] التعبير، والحصول على الصور ترنسفكأيشن بالتفصيل أدناه. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة لالجينومية تحديد الشركاء التفاعل البروتين، مثل الخميرة HY اثنينbrid، وهذا الأسلوب يسمح التصور من مجمعات البروتين في خلايا الثدييات في الموقع الفرعي الخلوية من التفاعل من قبل الفحص المجهري على أساس بسيط. يمكن بالتالي يتم تقييم كل من الميزات النوعية، مثل أنماط الترجمة، فضلا عن قوة الكمي للتفاعل.
الاستنساخ التعبير هو أداة قوية التي استخدمت في الماضي لتحديد المكونات الخلوية رواية مثل مستقبلات مستضدات الفيروسات وخلايا الدم 12. هنا، نحن تصف طريقة لتسهيل التعرف على الرواية المفترضة مستقبلات نقل الإشارة التي تربط لGrb2.
هناك بضع خطوات حاسمة في البروتوكول.
وقد استخدم الفحص إزفاء Grb2 من قبل مجموعات أخرى لتحديد جزيء صغير مثبطات كيناز تفعيل EGFR 6. في هذه الحالة، يتم تنشيط EGFR على وجه التحديد مع يجند تسبب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. ويمكن بعد ذلك تعطيل هذا التفاعل يتم التحقيق باستخدام مركبات جزيء صغير. وبالمثل، فإنه يمكن تصور أن يمكن استخدام شاشات سيرنا الذاتية لتحديد الجينات المشاركة في EGFR-Grb2 إشارات أو غيرها من عامل النمو Grb2 ملزم المستقبلات مثل C-KIT أو مستقبلات إرثروبويتين. وبالتالي، هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذه التقنية. ويمكن تطبيق نهج مماثل لأنظمة مراسل GFP الموسومة لجزيئات أخرى مثل محول حالات العسر الشديد، أو جاب IRS.
واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص خلية القاعدة في خلايا الثدييات هو أنه يمكن تحديد الرطوبة من الناحية الفسيولوجيةالتفاعلات evant. الفحص هو قراءات لتشكيل البروتين معقدة، ولكن الأهم من ذلك، يتم رصد التفاعلات ذات الصلة في موقع شبه الخلوية الصحيح. وفي هذا الصدد، يتغلب على هذه التقنية الفنية من غيرها من وسائل التفاعل البروتين البروتين مثل الخميرة الهجين اثنين أو في المقايسات المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن التفاعلات غير مباشرة قد يؤدي أيضا إلى تجنيد Grb2. وبالمثل، قد يكون ذلك حافزا ليصل النسخي تنظيم الشركاء ملزمة التعبير [كدنا]. للتمييز بين هذه الاحتمالات، فمن الضروري لتنفيذ المقايسات المناسبة الثانوي للتمييز بين الآثار المباشرة وغير المباشرة ملزمة.
في الختام، إزفاء جزيء GFP-محول فحص وعود قدرة عالية على فحص الجينوم على نطاق والتطبيقات اكتشاف المخدرات.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية وماري كوري الدولية مخطط المنح إعادة الإدماج (لJKV).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |