Identificación de los complejos de proteínas en<em> Escherichia coli</em> La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Summary

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la bacteria<em> Escherichia coli</em> Que se puede utilizar para aislar y caracterizar proteínas estables de múltiples complejos a cerca de homogeneidad incluso partiendo de bajo número de copias por célula.

Abstract

Como la mayoría de los procesos celulares están mediadas por las asambleas macromoleculares, la identificación sistemática de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la identificación de la composición de la subunidad de multi-proteína complejos pueden dar una idea de la función de genes y mejorar la comprensión de los sistemas biológicos ^{1, 2.} Interacciones físicas se pueden mapear con alta confianza vialarge escala aislamiento y caracterización de complejos de proteínas endógenas en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas basado en la purificación por afinidad de proteínas cromosómicamente etiquetados en combinación con espectrometría de masas (APMS). Este enfoque ha sido aplicado con éxito en diversos organismos evolutivamente, incluyendo levaduras, moscas, gusanos, células de mamíferos, bacterias y ^1-6. En particular, hemos generado una afinidad carboxi-terminal del péptido secuencial (SPA) Sistema de marcado doble para los complejos de purificación por afinidad de proteínas nativas de cultivos de bacterias gram-negativas Escherichia coli, utilizando genetically-tratables cepas huésped de laboratorio que están bien adaptados para todo el genoma investigaciones de la biología fundamental y los procesos conservados de procariotas ^{1, 2, 7.} Nuestro SPA-tagging sistema es análogo al método de purificación de afinidad en tándem desarrollado originalmente para la levadura ^{8, 9,} y consta de un péptido de unión a calmodulina (CBP), seguido por el sitio de escisión para la proteasa altamente específica tabaco etch virus (TEV) y tres copias del epítopo FLAG (FLAG 3X), permitiendo por dos rondas consecutivas de enriquecimiento de afinidad. Después de la amplificación casete, específicas de secuencia lineales productos de PCR que codifican el SPA-tag y un marcador seleccionable se integran y se expresa en marco como carboxi-terminal de fusiones en un fondo DY330 que es inducida para expresar transitoriamente un muy eficiente sistema de recombinación heteróloga bacteriófago lambda ^10. Posterior de doble etapa de purificación usando calmodulina y anti-FLAG perlas de afinidad permite que el altamente selectivoy la recuperación eficaz de incluso complejos de baja abundancia de proteínas de cultivos a gran escala. La espectrometría de masas se utiliza para identificar los purificadores de manera estable co-proteínas con alta sensibilidad (bajos límites de detección de nanogramos).

A continuación, describimos detalladas paso a paso los procedimientos que comúnmente se utilizan para el etiquetado sistemático de proteínas, purificación y espectrometría de masas basado en el análisis de complejos de proteínas solubles de E. coli, que pueden ser ampliadas y potencialmente adaptado a otras especies bacterianas, incluyendo ciertos patógenos oportunistas que son susceptibles de recombinería. Las interacciones físicas resultantes a menudo pueden revelar interesantes componentes y conexiones inesperadas que sugieren nuevos enlaces mecánicos. La integración de los datos de PPI con alternativas datos de la asociación molecular, tales como genéticos (gen-gen) las interacciones y el contexto genómico-(GC) predicciones pueden facilitar la elucidación de la organización mundial molecular de los complejos multi-proteína dentro de bivías metodológicas. Las redes generadas por E. coli se puede utilizar para obtener una perspectiva de la arquitectura funcional de los productos de genes ortólogos en otros microbios para que las anotaciones funcionales están faltando.

Protocol

1. Construcción de Genes específicos de SPA-tagging en E. DY330 coli cepa El plásmido pJL148 que abarca la secuencia de ADN SPA-tag y el antibiótico kanamicina casete marcador de resistencia (Kan R) se utiliza como una plantilla en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) 7. A 45 nt de genes específicos de cebador directo, que se encuentra inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen diana en el marco con un 27 bp ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAG…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Un aspecto clave del enfoque basado en SPA APMS descrito aquí es que el marcado se realiza en el contexto cromosómico natural, garantizando así la regulación de genes normales se mantiene (es decir. Cebo promotor nativo conserva, por lo tanto, los niveles de expresión no es perturbado) y nativo de manera estable asociada a complejos de proteínas se recuperan casi a los niveles endógenos. Cuestiones operón polaridad también se evitan mediante la inclusión de un promotor orientada hacia fuera en el marc…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid