질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명<em> 대장균</em>도 셀 당 낮은 사본 번호부터 근처의 동질성에 안정적인 멀티 단백질 복합체를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수있는.
대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 – 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 1, 2의 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 – 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 – 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes 1, 2, 7 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically – 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 8, 9 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 (10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 – 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다.
여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 – 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 혁신 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 혁신의 온타리오 교육부, 그리고 JG에 건강 연구 기금의 캐나다 연구소와 AE 적목 표현 E.에 대한 캐나다 재단에서 기금에 의해 지원되었다 대장균은 변형 DY330는 도널드 L. 법원 (국립 암 연구소, 프레데릭, MD)에서 일종의 선물이었다.
Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
I. Antibiotics | |||
Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
2. Terrific-Broth medium | |||
Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
Loading dye | NEB | #B7021S | |
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
DNA ladder | NEB | #N3232L | |
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
6. PCR and Transformation Equipments | |||
Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
7. Electrophoresis and Western blotting | |||
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
n-butanol | Sigma | # B7906 | |
TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
8. Sonication Equipment and Reagents | |||
Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
10. Silver Staining Reagents | |||
Methanol | Bioshop | #MET302 | |
Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
Formic acid | Sigma | #F0507 | |
HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
12. Labware | |||
4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
-80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |