のタンパク質複合体の同定<em>大腸菌</em>タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた
Summary
マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明<em>大腸菌</emでも、セルあたりの低コピー数から始まるほぼ均一に安定した多タンパク質複合体を分離し、特徴付けるために使用することができます>。
Abstract
ほとんどの細胞プロセスを高分子アセンブリによって媒介されているので、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）および多タンパク質複合体のサブユニット組成の同定を体系的に同定は、遺伝子の機能への洞察を提供し、生物学的システム1,2の理解を高めることができます。物理的な相互作用は、質量分析法（APMS）と組み合わせて染色体タグ融合タンパク質のアフィニティー精製に基づいて近い生理的条件下で内因性のタンパク質複合体の高い信頼vialargeスケールの単離および特性をマッピングすることができます。このアプローチは正常酵母、ハエ、虫、哺乳類細胞、細菌1月6日を含め進化的に多様な生物に適用されています。特に、我々はGEを使用して、培養したグラム陰性大腸菌からアフィニティー精製、天然のタンパク質複合体のためのカルボキシ末端シーケンシャルペプチドアフィニティー（SPA）をデュアルタギングシステムを生成した基礎生物学と生物1、2、7の保存プロセスのゲノムワイドな研究に適していnetically-扱いやすいホスト実験室株。当社SPA-タグシステムは、酵母8,9のために最初に開発されたタンデムアフィニティー精製法に類似していて、非常に特異的なタバコエッチウイルス （TEV）プロテアーゼと3つのコピーの切断部位が続くカルモジュリン結合ペプチド（CBP）から構成されていFLAGエピトープ（3X FLAG）の、親和性濃縮の2連続ラウンドを可能にする。カセットの増幅後、SPA-タグおよび選択可能なマーカーをコードする配列特異線形PCR産物が統合されており、一時的に非常に効率的な異種バクテリオファージラムダ組換え系10の発現が誘導さDY330背景にカルボキシ末端融合としてフレームで表現されます。カルモジュリンと抗FLAGアフィニティービーズを使用して、後続のデュアルステップ精製が高度に選択が可能大規模な文化からでも低濃度のタンパク質複合体と効率的な回収。タンデム質量分析を高感度（低ナノグラム検出限界）で安定して共同精製タンパク質を同定するために使用されます。
ここでは、 大腸菌由来の可溶性タンパク質複合体の精製と質量分析ベースの分析、我々は一般的に体系的タンパク質のタグ付けに使用する詳細なステップバイステップの手順を説明します大腸菌 、スケールアップと潜在的にコンビに従順である特定の日和見病原体を含む他の細菌種に合わせて調整することができます。結果の物理的相互作用は、しばしば小説序のリンクを示唆して興味深い予想外のコンポーネントと接続を明らかにすることができます。予測はBI内多タンパク質複合体のグローバルな分子組織の解明を容易にすることができますこのような遺伝的（遺伝子遺伝子）の相互作用とゲノム·コンテキスト（GC）などの代替分子会合データとPPIデータの統合ological経路。 大腸菌に対して生成されたネットワーク大腸菌は、機能アノテーションは現在欠けているために他の微生物のオーソログ遺伝子産物の機能アーキテクチャへの洞察を得るために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するSPAベースAPMSアプローチの重要な側面は、タギングがそれによって正常な遺伝子調節を確保し、自然な染色コンテキスト内で実行される維持（ すなわち 。ネイティブ餌プロモーターが保持され、それ故に発現レベルが乱されていない）と安定的に結合したネイティブであるということですタンパク質複合体は、近内在性レベルで回収される。オペロンの極性の問題は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、イノベーションのためのカナダの財団、ゲノムカナダ、オンタリオゲノム研究所、イノベーションのオンタリオ州省、JGとAE赤発現大腸菌にヘルスリサーチ助成のカナダの協会からの資金によってサポートされていました大腸菌株DY330は、ドナルド·L·コート（米国国立がん研究所、フレデリック、メリーランド州）からの親切な贈り物だった。
Materials
| Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
|
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
References
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