Una misión fundamental de la biología celular es definir los mecanismos que subyacen a la identidad de los orgánulos que hacen que las células eucariotas. Aquí proponemos un método para identificar los genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas mediante microscopía de fluorescencia y la próxima generación de herramientas de secuenciación.
Este protocolo describe un microscopio de fluorescencia basada en el cribado de las plántulas de Arabidopsis y se describe cómo asignar las mutaciones recesivas que alteran la distribución subcelular de un marcador específico etiquetado fluorescente en la vía secretora. Arabidopsis es un poderoso modelo biológico para estudios genéticos debido a su tamaño del genoma, tiempo de generación y conservación de los mecanismos moleculares entre reinos. La matriz de genotipado como una aproximación al mapa de la mutación en alternativa al método tradicional, basado en marcadores moleculares, es ventajoso porque es relativamente más rápido y puede permitir la asignación de varios mutantes en un marco de tiempo muy corto. Este método permite la identificación de proteínas que pueden influir en la integridad de cualquier orgánulo en las plantas. Aquí, como un ejemplo, proponemos una pantalla para los genes del mapa importantes para la integridad del retículo endoplasmático (ER). Nuestro enfoque, sin embargo, se puede extender fácilmente a otros orgánulos de las células vegetales(Véase por ejemplo 1,2), y por lo tanto representa un paso importante hacia la comprensión de las bases moleculares que rigen en otras estructuras subcelulares.
Aquí se describe una confocal de microscopía basada en el cribado para la identificación de mutantes endomembrane. Este enfoque se puede extender fácilmente a otros orgánulos de la célula para que determinados marcadores de proteínas fluorescentes están disponibles. La pantalla se basa en la identificación de mutantes que muestran una distribución aberrante del marcador fluorescente o bien en el orgánulo meta o para orgánulos que no se supone que contienen el marcador. Respectivamente, estos mutantes represe…
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos el apoyo de la Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia, EE.UU. Departamento de Energía (número de adjudicación DE-FG02-91ER20021) y la National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Estamos muy agradecidos a la Sra. Karen Bird para la edición del manuscrito.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
NaOAc | J.T Baker | |
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |