Основной квест в клеточной биологии является определение механизмов, которые лежат в основе личности органеллы, которые делают эукариотических клеток. Здесь мы предлагаем метод для идентификации генов, ответственных за морфологической и функциональной целостности растительного органелл с помощью флуоресцентной микроскопии и следующее поколение инструментов последовательности.
Этот протокол описывает флуоресцентного микроскопа на основе проверки Arabidopsis саженцев и описывает, как отобразить рецессивные мутации, которые изменяют субклеточных распределение конкретных помеченный флуоресцентного маркера в секреторный путь. Arabidopsis является мощной биологической модели для генетических исследований, поскольку его размер генома, Время создания и сохранения молекулярных механизмов между царствами. Массив генотипирования, как подход к карте мутации в альтернативу традиционным методом, основанным на молекулярные маркеры выгодно, потому что это сравнительно быстрый и может разрешить отображение нескольких мутантов в очень короткие сроки. Этот метод позволяет идентифицировать белки, которые могут повлиять на целостность любой органеллы растений. Здесь, как, например, мы предлагаем экран карту генов, важных для целостности эндоплазматического ретикулума (ЭР). Наш подход, однако, можно легко распространить и на другие органеллы растительной клетки(См., например, 1,2), и, следовательно, представляет собой важный шаг на пути к пониманию молекулярных основ, регулирующих другие субклеточные структуры.
Здесь мы описали конфокальной микроскопии скрининга для идентификации endomembrane мутантов. Этот подход можно легко распространить и на другие органеллы клетки, для которых конкретные флуоресцентные маркеры белка имеются. Экран на основе идентификации мутантов, которые показывают, анома…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем, поддержка со стороны химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке, Министерство энергетики США (награда номер DE-FG02-91ER20021) и Национальный научный фонд (MCB 0948584) (FB). Мы благодарны г-жа Карен птица для редактирования рукописи.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
NaOAc | J.T Baker | |
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |