والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.
هذا البروتوكول يصف مضان المجهر القائم على فحص الشتلات Arabidopsis ويصف كيفية تعيين الطفرات المتنحية التي تغير توزيع التحت خلوية من علامة محددة فلوري المفتاحية في مسار إفرازية. Arabidopsis هو نموذج قوي البيولوجية للدراسات الجينية بسبب حجم الجينوم، الوقت جيل، والمحافظة على الآليات الجزيئية بين الممالك. الصفيف التنميط الجيني كنهج لرسم خريطة للطفرة في بديل للطريقة التقليدية القائمة على المؤشرات الجزيئية هو مفيد لأنه هو أسرع نسبيا، ويمكن السماح لرسم الخرائط من المسوخ عدة في فترة زمنية قصيرة حقا. وتسمح هذه الطريقة في تحديد البروتينات التي يمكن أن تؤثر على سلامة أي عضية في النباتات. هنا، على سبيل المثال، فإننا نقترح على شاشة لخريطة الجينات مهمة لسلامة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا). نهجنا، ومع ذلك، يمكن أن تمتد بسهولة إلى غيرها من عضيات الخلية النباتية(انظر على سبيل المثال 1،2)، وهكذا يمثل خطوة هامة نحو فهم الأسس الجزيئية التي تنظم الهياكل التحت خلوية أخرى.
وصفها هنا لدينا متحد البؤر المجهري القائم على فحص لتحديد الطفرات endomembrane. ويمكن تمديد هذا النهج بسهولة إلى العضيات الأخرى في الخلية التي بعلامات محددة بروتين فلوري المتاحة. ويستند الشاشة على تحديد الطفرات التي تظهر توزيع الشاذة من علامة فلوري إما في العضية المستهدفة…
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الكيميائية، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة، مكتب العلوم الأساسية للطاقة، ومكتب للعلوم، وزارة الطاقة الأميركية (عدد جائزة DE-FG02-91ER20021) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0948584) (اف ب). نحن شاكرون لكارين بيرد السيدة لتحرير المخطوطة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
NaOAc | J.T Baker | |
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |