Adenovirüs ile temel insan otoantijen ifade farelerin Enfeksiyon, CYP2D6 geniş hepatit, fibrozis ve kuşak tarafından karakterize otoimmün aracılı karaciğer hastalığı kalıcı bir form Tip 2 otoimmün hepatit sonuçları muzdarip hastaların sera tarafından tanınan P450 2D6 (hCYP2D6) sitokrom -belirli bir bağışıklık yanıtı.
Otoimmun hepatit, nedeni bilinmeyen, 1,2 karaciğer nadir fakat hayatı tehdit eden otoimmün bir hastalıktır. , Geçmişte bir pek çok girişimlerine In profilini iyileştiren,,,,,, insan hastalığı (3-5) of karakteristik özellikleri yansıtıp yansıtmadığını, bir hayvansal modeli üretmek etmek Yaptı> edilmiştir> adres. Bununla birlikte olarak,, çeşitli modeller in, hastalığı of indüksiyon daha ziyade karmaşık idi ve: sık sık hepatit 3-5 sadece transient idi. Bu nedenle, Tip 2 otoimmün hepatit (AİH-2), yani hCYP2D6, 6 gibi bir tetikleyici en önemli insan otoantijen kullanan basit bir fare modeli geliştirdik. HCYP2D6 tanıma Tip 1 karaciğer-böbrek mikrozomal antikor (LKM-1) antikorlar AİH-2 7,8 işaretidir. Wild tip FVB veya C57BL / 6 farelerde içine teslim hCYP2D6 karaciğer tetiklenmesi antijen doğrudan teslim edilmesini sağlayan bir Adenovirüs construct (Ad-2D6) oldu. Böylece, takip eden yerel inflamasyon, otoimmünite sonraki gelişmesi için verimli bir alan 9 oluşturur. Bir cAd-2D6 intravenöz ve intraperitoneal ombination karaciğer uzun ömürlü otoimmün hasarı (bölüm 1) ikna etmek için en etkili yoludur. Burada karaciğer hastalığı, CYP2D6 modeli indüklenir ve nasıl karaciğer hasarının farklı yönlerini nasıl tespit edilebilir otoimmün ayrıntılı bir protokol sağlar. Birincisi, hepatosit gibi aminotransferazlar yıkımı, yanı sıra hCYP2D6 antikor titreleri gösteren belirteçlerin serum düzeyleri kan retroorbitaly (bölüm 2) örnekleme yoluyla belirlenir. Second olarak, hCYP2D6-spesifik bir bir, hala devam eden T bir hücre yanıtı,,,, spleen ve karaciğer from lenfositleri toplamaya kullanıcısı tarafından karakterize edilen edilir. Saf karaciğer lenfositler elde etmek için, ciğeri kollajen sindirilir ve bir Percoll degrade (Bölüm 4) üzerinden arıtılmış portal ven (bölüm 3), ile PBS ile perfüze. , HCYP2D6-spesifik bir T hücreleri of frekans,, hCYP2D6 peptidler, ve, flow sitometri tarafından – IFNγ-üreten hücreleri (bölümünde sık kullanılan 5) of tanımlama ile birlikte daha fazla stimülasyon kullanıcısı tarafından analiz edilir. Üçüncü olarak,hücre infiltrasyonu ve fibrozis, karaciğer bölümler (bölüm 6) immünohistokimyasal olarak tespit edilmiştir. Böyle bir analizi bir rejim ile,,,,,,, modeli of, kronik bir bir doğa kanıtlamak etmek sipariş in,,, hastalığı of inisiyasyon sonra birkaç Zamanlar at yürütülmüştür uygulanmaz etmek sahiptir. ,,,,, Frekans ve aktivitesi,, hCYP2D6-, belirli bir T ve / ya da Yatak-hücreleri of ve karaciğer damage gibi mi ve fibrosis of mi derecesi kullanıcısı tarafından karakterize edilen bağışıklık bir yanıtı of magnitude,,,,, önlemek, geciktirmek ya da, autodestructive FESHETME etmek, mümkün olan tedaviler of, bir müteakip bir bir değerlendirmenin için değerlendirilecektir uygulanmaz etmek var , karaciğer of süreç.
Daha önceki çalışmalarda, deneysel Hepatit genellikle otoimmün karaciğer hastalığı için sadece geçici ve birçok güncel modeller oldukça kompleks bir hastalıktır indüksiyon protokolleri (değerlendirmeleri 3,5 bakınız) bağlı olduğu rapor edilmiştir. Örneğin, çeşitli modeller, belirli bir hedef antijenlerini eksprese eden transgenik fareler kullanmak ve adoptively hedef antijene özgü, çoğunlukla TCR-transgenik T hücreleri 14,15 aktarılır. Sıklıkta, livertropic,, virüsler, bakteriler ya da Parazitlerin ile birlikte, bir ek bir bir bir bir enfeksiyon,,, hastalığı 16-18 indüklemek etmek gerekli olan konumundadır. Alternatif olarak,,, CYP2D6'nın 19 de dahil olmak üzere, target antijenleri,, için kodlandığında plazmidler ile birlikte DNA-aşılama,,,, hepatit indüklemek için kullanılan edilir. Bununla birlikte,,,,, bu tür, IL-12, gibi pro-inflamatuvar sitokinlerin,, için kodlandığında plazmidler ile birlikte, bir ek bir bir aşılama (20,) gereklidir edilir. Ne yazık ki, birkaç istisna dışında sadece geçici 15,20 hepatit.
CYP2D6 modeli 6,21 basit bir yöntem t kullanıro sadece Adenovirüs hCYP2D6, AİH-2 7,8 büyük otoantijen ifade bir ile enfekte fareler tarafından otoimmün hepatit neden. CYP2D6 bir adenovirüs yapı tarafından teslim etmesi, karaciğer doğrudan hedefleme yanı sıra hoşgörü dökümünü teşvik eden bir lokal inflamasyon garanti eder. Ancak virüs titresi yanı sıra yönetim rota bu model için çok önemli olduğunu not etmek önemlidir. Reklam,, birini elini On,-, 2D6,, böylece,,, bir Replikasyonu noksan virüs konumundadır, virüs of, bir yeterli bir bir bir, yüksek titresinde,, karaciğer mesafede olan, antijen of, bir kritik bir bir bir miktarını üretmek etmek, gereklidir edilir. ., Diğer bir elini On,, yüksek çok, bir titresinde,,,, bir fatal bir,, akut bir karaciğer başarısızlık in sonuçlanabilir gidebilecek. Buna ek In, it,,, adenovirus of, yüksek titreleri kullanıcısı tarafından fareler of enfeksiyon, bağışıklık bir yanıtı (22) of, bir fonksiyonel bir bir bir bitkinlik, etmek yol açar olduğunu, daha önceden göstermiştir olmuştur. Bizim modeli In, biz,, her ikisi de, kronik bir hücresel bir infiltrasyonunu yanı sıra gibi ext ile elde etmek için,, sipariş in,, intravenöz ve intraperitoneal olarak enfeksiyon of, bir kombinasyon kullanılanensive fibrozis. Biz tek başına intravenöz enfeksiyon hala büyük bir hücre infiltrasyonu neden olur, ama subkapsüler bölgede, intraperitoneal nedeniyle peritoneal inflamasyon gösteren hiçbir fibrozis, kollajen sürekli subkapsüler birikimi (Hintermann & Christen, lığa) dahil olabilir gözlemledik. Ancak, Ad-, GFP veya Reklam-Kontrol 23 eşit virüs titresi enfeksiyondan sonra Karaciğer yıldızsı hücreleri ve kollajen depolanması aktivasyonu tespit etmedi bu yana gözlenen karaciğer fibroz, antijen-özel olduğunu not etmek önemlidir.
CYP2D6 modeli gibi kalıcı hücre infiltrasyonu ve karaciğer fibrozu 6 ile karakterize kronik hepatit A gibi pek çok açıdan, insan AİH 1,2 yansıtır. Buna ek In,,,,, 'e benzer bir epitopunu spesifisite ve, in AIH-2 hastalarda bulundu: LKM-1 antikorlar etmek tıklayınız. Yayılıyor 13 -. Ile birlikte, yüksek-titresinde anti–Toplam CYP2D6'nın antikorlar of varlığında,,,,, pre gösteriryaygın bir kronik otoimmün reaktivite seçilecek eserlerin çalışılmasıdır. CYP2D6'nın,,,, AIH-2 'in major bir antijen konumundadır,, ancak it,, daha fazla sık sık olan type 1 AIH ile birlikte tanısı konulan hastalarda kullanıcısı tarafından tanınan değil edilir. Buna ek olarak, otoimmün etiyoloji ile diğer karaciğer hastalıkları, primer biliyer siroz (PBC) veya primer sklerozan kolanjit (PSC) gibi muzdarip hastalar, damgasını otoantikorlar oluşturmak farklı, karaciğer otoantijenlere ve ciğeri belirleyicilik küçük boyutlu merkezleme farklı patolojik özellikler (PBC göstermektedir ) veya büyük (PSC) safra yolları. Bununla birlikte,, CYP2D6 modelleri, hepatositlerin otoimmün imha sürücü ve hastalığı tedavi etmek mümkün terapötik müdahaleyi değerlendirmek için anahtar oyuncular tanımlamak için, otoimmün karaciğer hastalıkları sırasında ortaya çıkan kronik karaciğer inflamatuar süreçlerde yer immunopathogenic mekanizmalarını analiz etmek bir fırsat sunuyor.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Goethe Üniversitesi Hastanesi Frankfurt ve, UC Alman Araştırma Vakfı Hibe tarafından desteklenmektedir
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |