Infectie van muizen met een adenovirus uiting van de belangrijkste humane autoantigeen cytochroom P450 2D6 (hCYP2D6) erkend door sera van patiënten die lijden aan type 2-auto-immune hepatitis resulteert in een blijvende vorm van auto-immuun-gemedieerde lever ziekte die wordt gekenmerkt door uitgestrekte hepatitis, fibrose en genereren van een CYP2D6 -specifieke immuunrespons.
Auto-immune hepatitis is een zeldzame maar levensbedreigende auto-immuunziekte van de lever van onbekende etiologie 1,2. In het verleden vele pogingen zijn gegeven aan een dier model dat de kenmerken van de menselijke ziekte 3-5 weerspiegelt genereren. Echter, in verschillende modellen de inductie van ziekte vrij complex en vaak hepatitis was slechts voorbijgaande 3-5. Daarom hebben we een eenvoudige muis model dat de belangrijkste menselijke autoantigeen gebruikt bij type 2-auto-immuun hepatitis (AIH-2), namelijk hCYP2D6, als een trigger 6. Type 1 lever-nier-microsomale antilichamen (LKM-1) antilichamen die hCYP2D6 zijn de kenmerken van AIH-2 7,8. Levering van hCYP2D6 in wildtype FVB of C57BL / 6 muizen was door een Adenovirus construct (Ad-2D6) die een directe levering van de triggering antigeen naar de lever zorgt. Zo, de daaruit voortvloeiende lokale ontsteking zorgt voor een vruchtbaar veld 9 voor de verdere ontwikkeling van auto-immuniteit. A combination van intraveneuze en intraperitoneale injectie van Ad-2D6 is de meest effectieve route naar een duurzame auto-schade aan de lever (hoofdstuk 1) induceren. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over de manier waarop auto-immuun leverziekten wordt geïnduceerd in de CYP2D6 model en hoe de verschillende aspecten van de schade aan de lever kan worden beoordeeld. Eerst worden de serumwaarden van markers waaruit hepatocyte vernietiging, zoals aminotransferasen, evenals de titers van hCYP2D6 antilichamen bepaald door bemonstering bloed retroorbitaly (sectie 2). Tweede wordt de hCYP2D6-specifieke T cel respons gekenmerkt door het verzamelen lymfocyten uit de milt en de lever. Met het oog op pure lever lymfocyten te verkrijgen, worden de levers perfusie door PBS via de poortader (hoofdstuk 3), verteerd in collageen en gezuiverd over een Percoll gradiënt (hoofdstuk 4). De frequentie van hCYP2D6-specifieke T-cellen wordt geanalyseerd door stimulatie met hCYP2D6 peptiden en identificatie van IFNy-producerende cellen door flowcytometrie (deel 5). Third,cellulaire infiltratie en fibrose wordt bepaald door immunohistochemie van de lever secties (sectie 6). Dergelijke analyse regime moet worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen na initiatie van de ziekte om de chronische aard van het model bewijzen. De omvang van de immuunrespons gekenmerkt door de frequentie en activiteit van hCYP2D6-specifieke T en / of B cellen en de mate van de lever schade en fibrose beoordeeld moeten worden voor een volgende evaluatie van mogelijke behandelingen om verhinderen, vertragen of intrekking van de autodestructive proces van de lever.
In voorgaande studies werd experimentele hepatitis vaak naar verluidt slechts van voorbijgaande aard en veel van de huidige modellen voor auto-immuun leverziekten zijn afhankelijk van een vrij complexe ziekte inductie protocollen (voor reviews zie 3,5). Bijvoorbeeld diverse modellen gebruiken transgene muizen expressie van specifieke doel-antigenen en adoptief getransfereerd doelantigeen-specifieke, meestal TcR-transgene, T cellen 14,15. Vaak een extra infectie met livertropic virussen, bacteriën of parasieten noodzakelijk is ziekte 16-18 induceren. Alternatief wordt DNA-vaccinatie met plasmiden coderen voor target antigenen, met inbegrip CYP2D6 19, gebruikt om hepatitis induceren. Wordt echter een additionele vaccinatie met Plasmiden coderen voor pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-12, 20 vereist. Helaas, op enkele uitzonderingen na 15,20 hepatitis is slechts van voorbijgaande aard.
Het CYP2D6-model 6,21 maakt gebruik van een eenvoudige methode to veroorzaken auto-immune hepatitis door simpelweg te infecteren muizen met een adenovirus in hCYP2D6, de belangrijkste autoantigeen in AIH-2 7,8. Levering van CYP2D6 door een adenovirus constructie staat garant voor zowel een directe targeting van de lever en een lokale ontsteking die de afbraak van tolerantie bevordert. Het is echter belangrijk op constateren dat zowel het virus titer evenals de route van toediening is daarbij cruciaal model. Enerzijds, Ad-2D6 is een replicatie deficiënt virus dus een voldoende hoog titer van virus wordt noodzakelijk om een kritische hoeveelheid antigeen genereren binnen de lever. Anderzijds, zullen het ook hoge titer resulteren in een fataal acuut leverfalen. In Bovendien is al eerder aangetoond dat infecties van muizen door hoge titers van adenovirus leidt tot een functionele uitputting van de immuunrespons 22. In ons model, gebruikten we een combinatie van intraveneuze en intraperitoneale infectie teneinde zowel chronische cellulaire infiltratie alsmede ext verkrijgenensive fibrose. Wij hebben geconstateerd dat intraveneuze besmetting alleen nog steeds enorme cellulaire infiltratie veroorzaakt, maar geen fibrose van de subcapsulaire regio, waaruit blijkt dat peritoneale ontsteking als gevolg van de intraperitoneale injectie zou kunnen worden betrokken bij de continue subcapsulaire ophoping van collageen (Hintermann & Christen, manuscript in voorbereiding). Het is echter belangrijk op te merken dat de waargenomen leverfibrose is antigeen-specifieke, want we hebben de activering van leverstellaatcellen en collageen depositie niet detecteren na infectie met gelijke virus-titers van Ad-GFP of Ad-Control 23.
De CYP2D6 model weerspiegelt een groot aantal aspecten van het menselijk AIH 1,2, zoals chronische hepatitis gekarakteriseerd door aanhoudende cellulaire infiltratie en leverfibrose 6. In Bovendien, de aanwezigheid van hoge-titer anti-CYP2D6 antilichamen met soortgelijke epitoopspecificiteit en verspreiding 13 tot LKM-1-antilichamen gevonden in AIH-2 patiënten geeft de prewezigheid van een veel voorkomende chronische auto-immune reactiviteit. CYP2D6 is de belangrijkste antigeen in AIH-2, maar het wordt niet herkend door patiënten met de meer voorkomende type 1 AIH. Bovendien kunnen patiënten die lijden aan andere leverziekten met een auto-etiologie, zoals primaire biliaire cirrose (PBC) of primaire scleroserende cholangitis (PSC), het genereren van keurmerk auto-antistoffen met specificiteit voor verschillende lever autoantigenen en hun levers tonen verschillende pathologische kenmerken, gericht op kleine (PBC ) of grote (PSC) galwegen. Toch is het CYP2D6-modellen biedt de mogelijkheid om immunopathogenic mechanismen die betrokken zijn bij chronische lever-inflammatoire processen die optreden bij auto-immuun leverziekten, om de belangrijkste spelers die de auto-immune vernietiging van hepatocyten te rijden en om mogelijke therapeutische interventies te evalueren om de ziekte te genezen te identificeren analyseren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het Goethe-University Hospital Frankfurt en een subsidie van het Duitse Research Foundation naar UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |