小鼠与表达人类的主要自身抗原的腺病毒感染的细胞色素P450 2D6(hCYP2D6)血清持久的特点是广泛的肝炎,肝纤维化和生成一种CYP2D6的形式在介导的自身免疫性肝病患者患有2型自身免疫性肝炎的结果确认特异性免疫反应。
自身免疫性肝炎是一种罕见但危及生命的自身免疫性疾病的病因不明,1,2肝脏。在过去的许多尝试已作出生成一个动物模型,反映了人类疾病的特点3-5。然而,在各种型号的感应疾病是相当复杂的,往往肝炎只是短暂的3-5。因此,我们已经开发出一种简单的小鼠模型,在2型自身免疫性肝炎(AIH的-2),即hCYP2D6,使用人类的主要自身抗原作为触发6。 1型肝肾微粒体抗体(LKM-1)抗体承认hCYP2D6例AIH-2 7,8的标志。 hCYP2D6交付是由腺病毒结构(AD-2D6),确保触发肝抗原直接传送到野生型FVB或C57BL / 6小鼠。因此,随之而来的局部炎症产生的自身免疫性疾病的后续发展肥田9。一个CAD-2D6 ombination静脉注射和腹腔注射是最有效的途径,诱发一种持久的自身免疫性损害肝脏(1节)。在这里,我们提供了一个如何在CYP2D6模型诱导自身免疫性肝病和肝功能损害的不同方面如何可以评估的详细协议。首先,表明肝细胞的破坏,如转氨酶以及hCYP2D6抗体的滴度的血清标记确定采样的血液retroorbitaly(第2节)。其次,在hCYP2D6特异性T细胞反应的特点是通过收集脾淋巴细胞和肝脏。为了获得纯的肝细胞,肝脏灌注通过门静脉(第3)胶原蛋白和消化,通过Percoll梯度(第4)纯化,用PBS。分析与刺激hCYP2D6肽和鉴定流式细胞仪检测细胞IFNγ的生产(第5条)的hCYP2D6特异性T细胞的频率。第三,由肝部分(第6条)免疫组化细胞浸润和纤维化。这样的分析方案,以证明该模型的长期性疾病开始后要进行多次。特点是数量级的频率和hCYP2D6特异性T和/或B细胞的活性和肝损伤和肝纤维化程度的免疫反应,被评价为后续可能的治疗,以防止,延缓或废除autodestructive评估肝脏的过程。
在以往的研究,实验性肝炎经常报道只是短暂的,许多自身免疫性肝病的电流模式依赖于一个相当复杂的疾病诱导协议(评论见3,5)。例如,一些车型使用转基因小鼠表达特定的靶抗原,继转移目标抗原特异性的,大多是TCR转基因T细胞14,15。往往是必要的额外,与livertropic病毒,细菌或寄生虫感染诱发疾病16-18。另外,为靶抗原,包括CYP2D6的19,编码质粒DNA疫苗用于诱发肝炎。然而,额外的疫苗与质粒编码促炎细胞因子,如IL-12,20。不幸的是,有少数例外,15,20型肝炎仅是短暂的。
CYP2D6的模型6,21使用一个简单的方法TO诱导例AIH-2 7,8的主要自身抗原,表达hCYP2D6,腺病毒感染的小鼠自身免疫性肝炎。 CYP2D6的交付由腺病毒的结构,保证了肝脏的直接定位以及局部炎症,促进宽容破裂。这是重要的,但是要注意,病毒滴度以及给药途径是这种模式的关键。一方面,AD-2D6是一种复制缺陷病毒,因此,需要有足够高的病毒滴度肝脏内产生的抗原的关键。另一方面,滴度过高,可能会导致致命的急性肝功能衰竭。此外,它已被证明以前高滴度腺病毒的小鼠感染导致功能衰竭的免疫反应22。在我们的模型中,我们使用了静脉注射和腹腔感染的组合以获得慢性细胞浸润以及分机ensive纤维化。我们已经看到,单靠静脉注射感染仍然造成大量细胞浸润,但没有纤维化,表明由于腹腔注射,腹腔炎症,包膜地区可能会在胶原蛋白的不断的包膜积累(欣特曼和克里森,准备手稿)参与。然而,重要的是要注意观察肝纤维化是抗原特异性的,因为我们没有检测感染后,等于AD-GFP或Ad-23控制病毒滴度与肝星状细胞活化及胶原沉积。
CYP2D6的模型反映了人类AIH的1,2的许多方面,如慢性肝炎特点是持续性细胞浸润和肝纤维化6。此外,存在高滴度的抗体具有相似的抗原特异性和传播13例AIH-2患者中发现的LKM-1抗体的抗CYP2D6的指示前SENCE的一种常见的慢性自身免疫性反应。 CYP2D6的是,在2 AIH的主要抗原,但它不是由更频繁的1型AIH的确诊患者的认可。此外,病人患上其他肝病的病因与自身免疫性疾病,如原发性胆汁性肝硬化(PBC),原发性硬化性胆管炎(PSC),生成的标志抗体,显示特异性明显的肝自身抗原和肝脏不同的病理特点,围绕对小(中国人民银行)或大(PSC)的胆管。然而,CYP2D6的模型分析慢性肝脏炎症过程中涉及发生在自身免疫性肝病,确定关键的球员,推动肝细胞自身免疫性破坏,并评估可能治愈疾病的治疗干预的免疫病理机制提供了机会。
The authors have nothing to disclose.
支持这项工作是由歌德的法兰克福大学医院和德国研究基金会授予对UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |