Заражение мышей с аденовирус выражение основных человеческих аутоантигенов цитохром P450 2D6 (hCYP2D6) признан сыворотки пациентов, страдающих от 2 типа, аутоиммунный гепатит результаты в постоянной форме аутоиммунного-опосредованного заболевания печени характеризуется широким гепатит, фиброз и формирование CYP2D6 -специфического иммунного ответа.
Аутоиммунный гепатит является редким, но опасно для жизни аутоиммунное заболевание печени неизвестной этиологии 1,2. В прошлом многие попытки создать модель животного, который отражает особенности заболевания человека 3-5. Тем не менее, в различных моделях индукции болезнь была довольно сложной и часто гепатит был только переходным 3-5. Таким образом, мы разработали простой модели мыши, используются основные человеческие аутоантиген 2 типа аутоиммунный гепатит (АИГ-2), а именно hCYP2D6, как триггер 6. Тип 1 печени и почек микросомальные антитела (LKM-1) антител, распознающих hCYP2D6 являются отличительной чертой АИГ-2 7,8. Доставка hCYP2D6 в дикого типа FVB или C57BL / 6 мышей на аденовирус конструкции (Ad-2D6), что гарантирует прямые поставки запуска антиген печени. Таким образом, последующие местное воспаление создает благодатную почву 9 для дальнейшего развития аутоиммунных заболеваний. Сombination внутривенном и внутрибрюшинном введении Ad-2D6 является наиболее эффективным способом, чтобы вызвать длительную аутоиммунные повреждения печени (раздел 1). Ниже мы предлагаем подробный протокол о том, как аутоиммунные заболевания печени, индуцированных в CYP2D6 модели и, как различные аспекты поражения печени могут быть оценены. Во-первых, в сыворотке крови маркеров указывает гепатоцитов уничтожения, таких как аминотрансферазы, а также титры антител hCYP2D6 определяются путем отбора проб крови retroorbitaly (раздел 2). Во-вторых, hCYP2D6-специфических Т-клеточного ответа характеризуется сбор лимфоциты селезенки и печени. Для того чтобы получить чистый лимфоцитов печени, печень, которые перфузии по PBS через портальную вену (раздел 3), переваривается в коллагена и очищают на градиенте Перколла (раздел 4). Частота hCYP2D6 конкретных Т-клеток анализируется стимуляции hCYP2D6 пептидов и идентификацию IFNγ-продуцирующих клеток методом проточной цитометрии (раздел 5). В-третьих,клеточная инфильтрация и фиброз определяется иммуногистохимии печени секции (раздел 6). Такой режим анализ должен проводиться в несколько раз после начала болезни, чтобы доказать хронический характер модели. Величина иммунного ответа характеризуется частотой и деятельности hCYP2D6-специфических Т и / или В-клеток и степень повреждения печени и фиброз должны быть оценены для последующего анализа возможных методов лечения, чтобы предотвратить, задержать или отменить аутодеструктивное процесса в печени.
В предыдущих исследованиях, экспериментально гепатит часто сообщается, только переходные, и многие современные модели для аутоиммунных заболеваний печени зависит от сложного заболевания, а индукция протоколов (см. обзоры 3,5). Например, некоторые модели используют трансгенных мышей, экспрессирующих антигенов цели и восприимчиво переданы целевой антиген-специфические, в основном, TCR-трансгенной, Т-клетки 14,15. Часто дополнительной инфекции livertropic вирусами, бактериями или паразитами, необходимо, чтобы вызвать заболевание 16-18. Кроме того, ДНК-вакцинация плазмиды, кодирующие антигены цель, в том числе CYP2D6 19, используется, чтобы вызвать гепатит. Тем не менее, дополнительная вакцинация плазмиды, кодирующие провоспалительных цитокинов, таких как IL-12, требуется 20. К сожалению, за редкими исключениями 15,20 гепатита лишь временный характер.
CYP2D6 модель 6,21 использует простой метод тО вызывают аутоиммунный гепатит просто заражение мышей с аденовирус выражения hCYP2D6, основные аутоантиген в АИГ-2 7,8. Доставка по CYP2D6 аденовирус конструкция обеспечивает как прямое нападение на печень, а также местное воспаление, что способствует разрушение толерантности. Важно отметить, однако, что оба титра вируса, а также пути введения имеет решающее значение для этой модели. С одной стороны, Ad-2D6 является репликация вируса недостаточно, таким образом, достаточно высокий титр вируса требуется, чтобы создать критическую количество антигена в печени. С другой стороны, слишком высокий титр может привести к фатальной острой печеночной недостаточности. Кроме того, было показано ранее, что заражение мышей высокие титры аденовирус приводит к функциональному истощению иммунной реакции 22. В нашей модели мы использовали комбинацию внутривенного и внутрибрюшинного инфекции для того, чтобы получить как хронический клеточной инфильтрации, а также добensive фиброза. Мы заметили, что внутривенное заражение только до сих пор вызывает массовый клеточной инфильтрации, но не фиброза субкапсулярной регионе, о том, что воспаление брюшины вследствие внутрибрюшинного введения могут быть вовлечены в непрерывный субкапсулярной накопление коллагена (Хинтерманн и Кристен, рукопись готовится к печати). Тем не менее, важно отметить, что наблюдаемое фиброза печени является антиген-специфические, так как мы не обнаружили активация печеночных звездчатых клеток и коллагена после заражения вирусом равных титры Ad-GFP или Ad-управления 23.
CYP2D6 модель отражает многие аспекты человеческой 1,2 АИГ, таких как хронический гепатит характеризуется стойкими клеточная инфильтрация и фиброз печени 6. Кроме того, наличие высоких титров анти-CYP2D6 антител с аналогичной спецификой эпитоп и распространение 13 LKM-1 антител находится в АИГ-2 пациентов указывает на предварительноствие распространенных хронических аутоиммунных реактивности. CYP2D6 является основной антиген в АИГ-2, но он не признается пациентов с более частым АИГ 1 типа. Кроме того, пациенты страдают от других заболеваний печени с аутоиммунной этиологии, таких как первичный билиарный цирроз печени (PBC) или первичный склерозирующий холангит (PSC), генерировать признаком аутоантитела со специфичностью для различных аутоантигенов печень и печень, показать различные патологические особенности центровки на малых (PBC ) или большой (PSC) желчных протоков. Тем не менее, CYP2D6 моделей дает возможность анализировать immunopathogenic механизмов, участвующих в хронической печеночной воспалительные процессы, возникающие при аутоиммунных заболеваниях печени, для идентификации ключевых игроков, которые способствуют развитию аутоиммунной деструкции гепатоцитов, а также оценку возможных терапевтических вмешательств, чтобы вылечить болезнь.
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Гете университетской клиники Франкфурта и грант Немецкого исследовательского фонда в UC
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |