Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.
Un paso crítico y la limitación de frecuencia en la comprensión de la función de acogida y las proteínas virales es la identificación de la interacción de proteínas asociados celulares o virales. Existen muchos enfoques que permiten la identificación de socios que interactúan, incluyendo la levadura de dos sistema híbrido, así como derribar ensayos utilizando proteínas recombinantes y de inmunoprecipitación de las proteínas endógenas seguido por espectrometría de masa de identificación 1. Estudios recientes han puesto de relieve la utilidad de la doble purificación por afinidad mediada por la etiqueta, junto con dos pasos de elución específicos en la identificación de proteínas que interactúan. Este enfoque, denominado tándem Purificación por afinidad (TAP), se utilizó inicialmente en la levadura 2,3 pero más recientemente se ha adaptado para usar en células de mamífero 4-8.
Como prueba de concepto que hemos establecido una purificación por afinidad en tándem (TAP), utilizando la bien caracterizada iniciación de la traducción eucariótica factortor eIF4E 9,10. La traducción eIF4E factor celular es un componente crítico del complejo eIF4F celular implicada en la tapa que dependen de iniciación de traducción 10. La etiqueta TAP utilizado en el presente estudio se compone de dos unidades de proteína G y un péptido de unión de estreptavidina separados por un virus del Tabaco Etch (VET) secuencia de escisión de la proteasa. La etiqueta TAP utilizado en el presente estudio se compone de dos unidades de proteína G y un péptido de unión de estreptavidina separados por un virus del Tabaco Etch (VET) secuencia proteasa escisión 8. Para renunciar a la necesidad de que la generación de líneas celulares clonales, hemos desarrollado un sistema rápido que se basa en la expresión de la proteína TAP-etiquetados cebo de un plásmido episomal mantenido sobre la base de pMEP4 (Invitrogen). Expresión de eIF4E etiquetados murino de este plásmido se controla mediante el cloruro de cadmio promotor inducible metalotioneína.
La lisis de las células que expresan y purificación de afinidad posterior a través de la unión a Rabbit IgG de agarosa, la escisión VET proteasa, la unión a estreptavidina ligada agarosa y elución biotina posterior identificado numerosas proteínas aparentemente específicas para el eIF4E desplegable (en comparación con el control de líneas celulares que expresan la etiqueta TAP solo). Las identidades de las proteínas se obtuvieron mediante la escisión de las bandas de espectrometría 1D tándem SDS-PAGE y posterior masa. Los componentes identificados incluyen las proteínas de unión eIF4E conocidos eIF4G y 4EBP 1. Además, otros componentes del complejo eIF4F, de los cuales eIF4E es un componente fueron identificados, a saber eIF4A y Poly-Una proteína de unión. La capacidad de identificar no sólo se conocen los socios directos de unión, así como secundarias proteínas que interactúan, destaca aún más la utilidad de este enfoque en la caracterización de proteínas de función desconocida.
La técnica de marcado TAP ilustrado aquí demuestra un método altamente específico y estrictas para aislar las parejas de unión de proteínas de cebo en las células eucariotas. Este enfoque puede ser aplicado a las proteínas celulares y virales. A nuestro entender, esta es la primera vez que esta técnica aplicada a la traducción eIF4E factor de iniciación. Identificación de la eIF4G eIF4E conocido proteínas vinculantes y los 4EBPs uso de esta técnica se confirma la validez de este enfoque. Además, la identificación del componente restante del complejo eIF4F, a saber eIF4A, y PABP confirma que la interacción indirecta y complejos terciarios permanecer intacto durante el proceso de purificación. La identificación de múltiples isoformas de las proteínas de unión eIF4E canónicos era también evidente. Estos se describen con más detalle en la Figura 2.
En cuanto a las limitaciones del enfoque, la atención de algunos se debe tomar con respecto a la elecciónde proteína cebo y si o no para colocar la etiqueta TAG en el extremo N-o C-terminal. Podría ser conveniente para llevar a cabo un ensayo funcional o examinar la localización de la proteína de fusión con el microscopio antes de la purificación a gran escala para asegurar el derivado de etiquetado es funcional. Integral de la membrana o proteínas nucleares no necesariamente puede ser liberado por las condiciones relativamente suaves detergentes descritas en la etapa de lisis. Como con todas las inmunoprecipitaciones y similares ensayos desplegable, se podría hacer modificaciones a la naturaleza y concentración del detergente en el tampón de lisis para aumentar la eficiencia de la lisis. La concentración iónica de los tampones de lisis y lavado también puede modificarse para aumentar o disminuir la severidad de la purificación. También es posible llevar a cabo la purificación inicial bajo condiciones suaves estándar (descrito anteriormente), pero posteriormente dividir las perlas de estreptavidina (sección 5,8) en alícuotas de 4-5, que posteriormente se pueden lavar bajo con iónica crecientecondiciones. Esto puede permitir al usuario identificar las condiciones óptimas que eliminan proteínas no específicas que interactúan. Todo el proceso puede realizarse también utilizando la transfección transitoria cuando las distintas partes que interactúan son conocidos y su presencia o ausencia determinó por transferencia subsiguiente occidental solamente. En este caso, le sugerimos dos 100cm 2 placas de células transfectadas con cada uno de 8 g de plásmido de expresión. Este procedimiento modificado es de uso particular, al examinar la capacidad de los derivados mutantes de la proteína TAP fusión para interactuar con parejas de unión conocidas.
El análisis de las muestras 1 a 8 en la teñidos con plata geles SDS-PAGE (o por Western blot, si un anticuerpo está disponible) es una excelente forma de solución de problemas, si la técnica de no generar resultados aceptables. La eficacia de cada precipitación basado en la afinidad y la elución específica puede ser analizado utilizando este método de muestreo sistemático. Las muestras de uno a ocho se debe tomar durante Optimzación del protocolo para cada nuevo cebo.
La técnica de marcado TAP ofrece una alternativa potente y robusta con otros enfoques, tales como GST pull-downs, la levadura de dos ensayos de híbridos, etc La purificación por afinidad de matrimonio y los pasos específicos de elución (TEV división y la elución biotina) proporcionan la especificidad y el rigor que se mantiene a un alto nivel durante todo el procedimiento de purificación. Críticamente esta técnica se puede aplicar a cualquier proteína y por lo tanto representa un método excelente para la identificación de parejas de unión para una proteína diana de interés.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada por una beca de Wellcome Trust Superior otorgado al Dr. Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |