串联亲和纯化的蛋白结合合作伙伴的标识是稳健的做法。由于概念证明,这种方法的应用以及特色的翻译起始因子eIF4E共沉淀的宿主细胞因子参与翻译起始。这种方法是很容易适应任何细胞或病毒蛋白。
一个经常限制的关键一步,在了解主机和病毒蛋白的功能是相互作用的细胞或病毒蛋白伙伴的标识。有许多方法,使识别的互动合作伙伴,包括酵母双杂交系统,以及下拉检测用重组蛋白免疫沉淀和内源性蛋白质质谱鉴定1。最近的研究都强调实用的双亲和力标签介导的净化,再加上两个相互作用的蛋白质鉴定的具体洗脱步骤。这种方法称为串联亲和纯化(TAP)的,最初用于酵母2,3,但最近已经适应在哺乳动物细胞中的使用4-8。
作为证据的概念,我们已经建立了串联亲和纯化(TAP)的方法,利用良好的特点真核翻译起始因子TOR eIF4E的9,10。细胞翻译因子eIF4E是一个蜂窝eIF4F复杂的重要组成部分,涉及帽依赖的翻译起始10。在目前的研究中使用的TAP标签是两个G蛋白单位组成,由烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割序列1链亲和素结合肽的分离。在目前的研究中使用的TAP标签组成的两个G蛋白单位和1链亲和素结合肽的分离,由烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割序列8。放弃代克隆细胞系的需要,我们开发了一种快速的系统依赖于从episomally保持质粒的TAP标签的诱饵在pMEP4(Invitrogen公司)为基础蛋白表达。使用氯化镉诱导金属硫蛋白启动子控制的标签从这个质粒的小鼠eIF4E的表达。
通过结合到R的表达和随后的亲和纯化的裂解abbit抗体琼脂糖,TEV蛋白酶裂解,结合链霉联系琼脂糖和生物素洗脱随后确定了许多蛋白质显然是具体的eIF4E的下拉(时相比,控制细胞株单独表达TAP标签)。蛋白质的身份获得了从一维的SDS-PAGE和随后的串联质谱带切除。确定的组件包括知名eIF4E的结合蛋白eIF4G和4EBP-1。此外,eIF4F复杂的其他组成部分,其中eIF4E的是一个组件被确定,即eIF4A和聚A结合蛋白。识别能力,不仅直接约束力的合作伙伴以及二级相互作用的蛋白质,进一步突出了在未知功能的蛋白质的特性,这种方法的效用。
说明这里的TAP标签技术演示为诱饵蛋白在真核细胞中分离的具有约束力的合作伙伴的高度特异性和严格的方法。这种方法可应用于细胞和病毒蛋白。据我们所知,这是第一次,这种技术已被应用到翻译起始因子eIF4E。知名eIF4E的结合蛋白eIF4G和使用这种技术的4EBPs鉴定,证实了这种方法的有效性。此外,鉴定eIF4F复杂的剩余部分,即eIF4A和PABP至证实,间接的互动关系和大专院校的复合物留在净化过程中的完整。 eIF4E的结合蛋白的典型多个亚型的识别也很明显。图2中更详细地描述了这些。
至于该方法的局限性,某些保健应采取的选择与问候诱饵蛋白和是否放置在N-或C-末端的TAG标签。这可能是最好进行功能检测,或本地化融合蛋白通过显微镜检查,以确保标签的衍生工具是功能完整的大规模纯化。积分膜或核蛋白质不一定被释放裂解步骤中所述的条件相对温和的洗涤剂。与所有免疫沉淀和类似拉下来分析,修改,可以在提高效率的裂解裂解液的性质和浓度的洗涤剂。离子浓度的溶解和洗涤缓冲也可以修改,增加或减少净化的严格。它也可以执行初步净化温和条件下标准(如上所述),但随后分裂的链亲和素珠(5.8节)为4-5等份,随后被冲下离子浓度增加ditions。这可能使用户能够确定的最佳条件,消除非特异性相互作用的蛋白质。整个过程中也可以使用互动的合作伙伴被称为瞬时转染和随后印迹确定其存在或不存在。在这种情况下,我们建议各8微克的表达质粒转染细胞100厘米2菜。这个修改过程是研究突变衍生物的TAP融合蛋白与已知的具有约束力的合作伙伴互动的能力时,特定用途。
分析样品1,通过银染SDS-PAGE凝胶(或印迹,如果抗体是可用的)8,是一个很好的方法排除故障,技术故障产生可接受的结果。使用此系统抽样的方法,可以分析的基于每个亲和力的降水和具体洗脱效率。样品应采取一至八个期间OPTIM化的协议,为每个新的诱饵。
TAP标签技术提供了一个强大和稳健的替代其他方法,如GST拉,酵母双杂交实验等双亲和纯化和具体洗脱步骤(TEV酶切和生物素洗脱)提供特异性和严格保持在整个净化过程中的较高水平。批判这种技术可以应用到任何蛋白质,因此确定为目标蛋白结合合作伙伴的一个极好的方法。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由威康信托高级奖学金颁发给伊恩·古德费洛博士。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |