Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.
Une étape cruciale et souvent un facteur limitant dans la compréhension de la fonction de l'hôte et des protéines virales est l'identification des partenaires d'interaction des protéines cellulaires ou virales. Il existe plusieurs approches qui permettent l'identification des partenaires d'interaction, y compris la levure système à deux hybrides, ainsi que déroulez tests utilisant des protéines recombinantes et d'immunoprécipitation de protéines endogènes suivies par spectrométrie de masse d'identification 1. Des études récentes ont mis en évidence l'utilité de la double-purification par affinité médiation tag, couplé avec deux étapes d'élution spécifiques à l'identification des protéines qui interagissent. Cette approche, appelée Tandem Affinity Purification (TAP), a été initialement utilisée dans la levure 2,3, mais, plus récemment, a été adapté pour utiliser des cellules de mammifères 4-8.
Comme preuve de concept que nous avons mis en place un purification par affinité en tandem (TAP) en utilisant la méthode du bien caractérisé eucaryote initiation de la traduction facteur eIF4E 9,10. Le cellulaire de traduction eIF4E facteur est un élément essentiel du complexe eIF4F cellulaire impliquée dans cap-dépendante initiation de la traduction 10. La balise TAP utilisée dans l'étude actuelle est composée de deux unités de protéine G et un peptide de liaison streptavidine séparés par un virus etch du tabac (TEV) séquence de clivage de la protéase. La balise TAP utilisée dans l'étude actuelle est composée de deux unités de protéine G et un peptide de liaison streptavidine séparés par un virus etch du tabac (TEV) séquence de clivage de protéase 8. Pour renoncer à la nécessité pour la génération de lignées cellulaires clonales, nous avons développé un système rapide qui s'appuie sur l'expression de la protéine marquée par TAP-appâts à partir d'un plasmide épisomique maintenue sur la base pMEP4 (Invitrogen). Expression de eIF4E murin étiqueté à partir de ce plasmide a été contrôlé à l'aide du chlorure de cadmium métallothionéine promoteur inductible.
La lyse des cellules exprimant et purification par affinité ultérieure via la liaison à rabbit IgG agarose, clivage de la protéase TEV, la liaison à la streptavidine liée agarose et l'élution ultérieure biotine identifié de nombreuses protéines apparemment spécifiques à l'eIF4E déroulant (par rapport à contrôler des lignées cellulaires exprimant le tag TAP seule). Les identités des protéines ont été obtenues par l'excision des bandes de 1D spectrométrie de masse en tandem SDS-PAGE et les suivantes. Les composants identifiés comprenait les protéines eIF4E connus contraignantes eIF4G et 4EBP-1. En outre, d'autres composants du complexe eIF4F, dont eIF4E est un composant ont été identifiés, à savoir eIF4A et poly-Une protéine de liaison. La capacité à identifier non seulement connus directes des partenaires de liaison ainsi que les protéines en interaction, secondaires souligne en outre l'utilité de cette approche dans la caractérisation des protéines de fonction inconnue.
La technique de marquage TAP illustré ici montre une méthode hautement spécifique et rigoureux pour isoler les partenaires de liaison de protéines appâts dans des cellules eucaryotes. Cette approche peut être appliquée à des protéines cellulaires et virales. À notre connaissance, c'est la première fois qu'une telle technique a été appliquée à l'initiation de la traduction eIF4E facteur. Identification de la liaison eIF4E eIF4G connu protéines et les 4EBPs en utilisant cette technique confirme la validité d'une telle approche. En outre, l'identification de la composante restante du complexe eIF4F, nommément eIF4A, et PABP confirme que l'interaction indirecte et des complexes tertiaires restent intactes pendant le procédé de purification. L'identification des isoformes multiples des protéines de liaison eIF4E canoniques était également évident. Ceux-ci sont décrits plus en détail dans la figure 2.
En ce qui concerne les limites de l'approche, certains soins doivent être prises en ce qui concerne le choixde la protéine appât et si oui ou non de placer la balise TAG à l'extrémité N-ou C-terminale. Il pourrait être souhaitable de procéder à un test fonctionnel ou d'examiner la localisation de la protéine de fusion par microscopie avant la purification à grande échelle pour assurer le dérivé marqué est fonctionnel. Membranaire intégrale ou des protéines nucléaires ne sont pas nécessairement être libéré par les conditions relativement douces de détergent décrites dans l'étape de lyse. Comme avec tous les immunoprécipitations et similaires déroulants essais, modifications pourraient être apportées à la nature et les concentrations du détergent dans le tampon de lyse pour accroître l'efficacité de la lyse. La concentration ionique des tampons de lyse et lavage peut également être modifié pour augmenter ou diminuer la rigueur de la purification. Il est également possible d'effectuer la purification initiale en vertu de standards des conditions douces (décrit ci-dessus) mais par la suite diviser les billes de streptavidine (section 5.8) en aliquotes 4-5, qui peut ensuite être lavées sous con ionique croissanteconditions. Cela peut permettre à l'utilisateur d'identifier les conditions optimales qui éliminent les protéines non spécifiques qui interagissent. L'ensemble du processus peut également être effectuée à l'aide de transfection transitoire où les partenaires d'interaction sont connus et leur présence ou leur absence déterminée par western blot ultérieure seulement. Dans ce cas, nous suggérons deux 100cm 2 plats de cellules transfectées avec chaque 8 pg de plasmide d'expression. Cette procédure modifié est particulièrement utile lors de l'examen de la capacité des mutants dérivés de la protéine TAP-fusion d'interagir avec des partenaires de liaison connus.
Analyser les échantillons 1 à 8 sur argent colorées gels SDS-PAGE (ou par western blot si un anticorps est disponible) est un excellent moyen de dépannage, la technique devrait ne parviennent pas à générer des résultats acceptables. L'efficacité de chaque précipitation par affinité et élution à base spécifique peut être analysée à l'aide de cette méthode d'échantillonnage systématique. Les échantillons de un à huit doivent être prises lors optimsation du protocole pour chaque nouvel appât.
La technique de marquage TAP fournit une alternative puissante et robuste à d'autres approches telles que GST pull-bas, la levure deux essais hybrides etc purification par affinité double et étapes d'élution spécifiques (clivage TEV et l'élution biotine) de fournir la spécificité et la rigueur doit être maintenue à un niveau élevé tout au long de la procédure de purification. Critique cette technique peut être appliquée à n'importe quelle protéine et représente donc une excellente méthode pour identifier des partenaires de liaison pour une protéine cible d'intérêt.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par une bourse du Wellcome Trust principal décerné au Dr Ian Goodfellow.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |