טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.
שלב קריטי ולעיתים קרובות הגבלת בהבנת תפקידו של המארח חלבונים נגיפיים הוא זיהוי של אינטראקציה שותפים חלבונים תאיים או ויראלי. ישנן גישות רבות המאפשרות את הזיהוי של בני הזוג אינטראקציה, כולל מערכת שמרים 2 היברידית, כמו גם למשוך את מבחני באמצעות חלבונים רקומביננטי ו immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ואחריו זיהוי ספקטרומטריית מסה 1. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגיש את התועלת של טיהור פעמיים זיקה בתיווך תג, יחד עם שני צעדים elution ספציפיים זיהוי של חלבונים אינטראקציה. גישה זו, כינה טנדם טיהור זיקה (TAP), שימש בתחילה בשמרים 2,3 אך לאחרונה הותאם לשימוש בתאי יונקים 4-8.
כהוכחה מושג של הקמנו טיהור זיקה טנדם (TAP) שיטה באמצעות היטב מאופיין אוקריוטים תרגום ייזום FACטור eIF4E 9,10. eIF4E הסלולרי גורם התרגום הוא מרכיב קריטי של המתחם eIF4F הסלולר מעורב בייזום יתר תלויה התרגום 10. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס Etch טבק (TeV) מחשוף רצף פרוטאז. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס טבק Etch (TeV) מחשוף פרוטאז רצף 8. לוותר על הצורך של הדור של שורות תאים משובטים, פיתחנו שיטה מהירה שמסתמכת על הביטוי של החלבון-TAP מתויג הפיתיון מן הפלסמיד שמרו episomally מבוסס על pMEP4 (Invitrogen). ביטוי eIF4E Murine מתויג מזה פלסמיד נשלט באמצעות קדמיום כלוריד מושרה האמרגן metallothionein.
תמוגה של התאים המבטאים וטיהור זיקה לאחר מכן באמצעות קשירה Rabbit IgG agarose, מחשוף TeV פרוטאז, קשירה streptavidin agarose צמודות elution ביוטין לאחר מכן זיהו חלבונים ספציפיים רבים, ככל הנראה, eIF4E הנפתח (בהשוואה לשלוט שורות תאים המבטאים את תג TAP לבד). זהותם של חלבונים התקבלו על ידי כריתה של להקות מ 1D ספקטרומטריית SDS-PAGE ובעקבות המוני במקביל. המרכיבים שזוהו כללו את החלבונים eIF4E ידועים מחייבים eIF4G ו 4EBP-1. בנוסף, רכיבים אחרים של המתחם eIF4F, מתוכם eIF4E הוא מרכיב זוהו, כלומר eIF4A פולי ו-חלבון מחייב. היכולת לזהות לא רק בני זוג ידועים מחייבים ישיר, כמו גם חלבונים אינטראקציה משניים, מדגישה עוד יותר את התועלת של גישה זו באפיון של חלבונים של תפקוד לא ידוע.
תיוג TAP אייר הטכניקה כאן מדגים שיטה ספציפית מאוד מחמירים של בידוד השותפים מחייב של חלבונים בתאים האיקריוטים הפיתיון. גישה זו ניתן ליישם גם חלבונים תאיים ווירוסים. למיטב ידיעתנו, זוהי הפעם הראשונה כגון טכניקת הוחל eIF4E התחלת התרגום גורם. זיהוי eIF4G ידוע eIF4E חלבונים מחייב את 4EBPs באמצעות טכניקה זו מאשרת את תקפותה של גישה כזאת. בנוסף, זיהוי של הרכיב הנותר של המתחם eIF4F, כלומר eIF4A, ו PABP מאשר כי האינטראקציה עקיפה מתחמי שלישוני נותרו על כנן במהלך תהליך טיהור. זיהוי isoforms מרובות של החלבונים קנוניים מחייב eIF4e ניכרה גם. אלה מתוארים בפירוט רב יותר באיור 2.
לגבי המגבלות של הגישה, טיפול מסוים יש לנקוט לגבי הבחירהשל חלבון הפיתיון ואם לא למקם את תג TAG ב-N-C או הסופית. זה יכול להיות מומלץ לבצע assay תפקודית או לבחון את הלוקליזציה של החלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ לפני טיהור בהיקף מלא כדי להבטיח את הנגזרת מתויג הוא פונקציונלי. קרום נפרד או חלבונים גרעיני לא בהכרח שפורסמו על ידי התנאים חומר ניקוי עדין יחסית המתוארים בשלב תמוגה. כמו בכל immunoprecipitations ו דומים הנפתח מבחני, שינוי יכול להתבצע לטבע ריכוזים של חומר ניקוי במאגר תמוגה כדי להגביר את היעילות של תמוגה. ריכוז יוני של מאגרים תמוגה ולהתרחץ גם להיות שונה כדי להגדיל או להקטין את ההחמרה של טיהור. כמו כן ניתן לבצע טיהור ראשוני בתנאים קלים רגילים (כמתואר לעיל), אך לאחר מכן מחלקים את החרוזים streptavidin (סעיף 5.8) לתוך aliquots 4-5, שיכולים לאחר מכן להיות שטופים תחת קון יונית הגדלתditions. זה עשוי לאפשר למשתמש לזהות את התנאים האופטימליים, כי להסיר שאינם ספציפיים חלבונים אינטראקציה. התהליך כולו עשוי גם להתבצע באמצעות transfection חולף שבו השותפים באינטראקציה ידועים ונוכחותם או היעדרם נקבע על ידי כתם המערבי לאחר מכן בלבד. במקרה זה הייתי מציע שתי מנות של 100 ס"מ 2 תאים כל transfected עם מיקרוגרם 8 הביטוי פלסמיד. הליך זה שונה הוא השימוש בפרט כאשר בוחנים את היכולת של נגזרים מוטציה של חלבון TAP-Fusion לתקשר עם בני זוג ידועים מחייב.
ניתוח הדגימות 1 עד 8 על מוכתמים כסף SDS-עמוד ג'ל (או על ידי כתם המערבי אם נוגדן זמין) היא דרך מצוינת של פתרון בעיות, טכניקה לא תצליח להפיק תוצאות מתקבלות על הדעת. היעילות של משקעים כל זיקה מבוסס elution ספציפי ניתן לנתח שימוש בגישה זו דגימה שיטתית. דוגמאות אחד עד שמונה יש לנקוט במהלך optimשנפלו על הקרקע הפורייה של פרוטוקול לפיתיון כל חדש.
הטכניקה תיוג TAP מספק אלטרנטיבה חזקה ויציבה לגישות אחרות כגון GST למשוך ומורדות, שמרים שני מבחני היברידיות וכו 'טיהור זיקה כפולה צעדים elution ספציפיים (מחשוף TeV ו elution ביוטין) לספק הספציפיות להחמיר כדי להישמר רמה גבוהה לאורך כל תהליך טיהור. קשה טכניקה זו ניתן להחיל על כל חלבון ולכן מייצג שיטה מצוינת לזיהוי שותפים מחייב עבור היעד חלבון של עניין.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לד"ר איאן גודפלו.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Hygromycin B | Roche | 10843555001 |
Rabbit IgG Agarose | Sigma | A2909 |
AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 |
Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 |
Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce | 53116 |
Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 |
SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 |
Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 |
Microcapillary pipette tips | VWR | 37001-150 |
NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX |
CdCl2 | Sigma | 202908 |
5x SDS Sample Buffer | Fisher | PN39000 |