Aquí se describe un método para visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón<em> En vivo</em>. Se basa en simultáneo de dos fotones de imágenes de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) y la microcirculación cortical. Este método es útil para el análisis de alta resolución de suministro de oxígeno del tejido.
La capacidad del cerebro para funcionar a un alto nivel de la demanda metabólica depende de la oferta continua de oxígeno a través del flujo sanguíneo y la difusión de oxígeno a los tejidos. Aquí se presenta un protocolo experimental, visualizar y metodológicos para visualizar directamente la hipoxia tisular y microrregional para inferir gradientes perivasculares de oxígeno en la corteza del ratón. Se basa en la relación no lineal entre dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) la intensidad de fluorescencia endógena y la presión parcial de oxígeno en el tejido, donde observó tejido NADH fluorescencia aumenta bruscamente en los niveles de oxígeno del tejido por debajo de 10 mmHg 1. Utilizamos dos fotones de excitación a 740 nm que permite la excitación simultánea de fluorescencia intrínseca del tejido NADH y el plasma sanguíneo en contraste con Texas-Red de dextrano. Las ventajas de este método sobre los métodos existentes incluyen los siguientes: toma ventaja de una señal de tejido intrínseco y se puede realizar utilizando el estándar de dos fotones en vivo imenvejecimiento de equipos, sino que permite la vigilancia continua en el campo de la vista con una resolución de profundidad de aproximadamente 50 micras. Se demuestra que las zonas de tejido cerebral más alejados de los vasos sanguíneos cerebrales corresponden a las cuencas hidrográficas vulnerables que son los primeros que se desempeñe con la hipoxia debido a una disminución en el suministro de oxígeno vascular. Este método le permite a uno la imagen cortical oxigenación microrregional y por tanto es útil para examinar el papel de la oferta tisular de oxígeno inadecuada o restringida en las enfermedades neurovasculares y los accidentes cerebrovasculares.
Información de alta resolución espacial sobre la difusión de oxígeno es importante para entender cómo el flujo sanguíneo en el cerebro se regulan para suministrar oxígeno a las células cerebrales, y para satisfacer la demanda metabólica. Tradicionales mediciones de oxígeno polarográfico con Clark al estilo de los electrodos de vidrio son altamente invasivos y tienen baja resolución espacial de 2-3 y el tiempo de respuesta significativa (segunda serie). Hasta el momento el único método no invasivo para medir la PO 2 en el tejido cerebral es apagar la fosforescencia, donde la tasa de descomposición de la sonda de excitación es proporcional a la concentración de oxígeno 4. Este método proporciona concentraciones exactas de oxígeno, sino que requiere un colorante específico y un técnico sofisticado sistema de vida de la fosforescencia de imagen. Este sentido, demuestran un enfoque directo, más simple que se puede realizar en un sistema de imágenes estándar de dos fotones con dos canales flurescence. Nuestro enfoque tiene la ventaja de una señal intrínseca del tejido 5 aª sólo requiere la visualización de contraste de la microcirculación cortical. Debido a la no-lineal, aumento esencialmente binaria de NADH fluorescencia a funcionalmente limitar las concentraciones de oxígeno 1, el aumento de la fluorescencia intrínseca NADH se observó sólo en áreas con hipoxia significativa, metabólicamente limitante. Una consecuencia importante es que los límites del tejido de la difusión de oxígeno de los microvasos corticales son directamente observables por los cambios de intensidad de forma cilíndrica de la fluorescencia endógena NADH. Nos referimos a estas estructuras como cilindros Krogh, porque el concepto de estructuras de forma cilíndrica que definen el volumen oxigenada del tejido que rodea los vasos sanguíneos fue presentado por August Krogh y ha sido recientemente observado experimentalmente con dos fotones NADH imagen 1. Cilindros Krogh imágenes se pueden recoger en 3D, a una z pila de cuadros de imagen. Son especialmente prominente en la vecindad de las arteriolas penetrantes y son congruentes ingenioh capilar agotadas cilindros periarteriolares tejidos 1,4.
Para proporcionar una determinación objetiva de la R tejido Krogh radio del cilindro (véase la sección 5.2) que mide los valores de intensidad de pixel radiales dentro de un segmento bien definido entre el centro del cilindro y el límite exterior mediante la función de Matlab "improfile". El límite exterior del segmento debe ser elegido para extender con un margen de seguridad más allá del límite visible. Para mejorar el nivel de señal a ruido nos averageed sobre todas las líneas radiales necesarios para cubrir el segmento visible del cilindro en pasos de 1 °. El perfil medio resultante intensidad radial dentro del segmento exhibió un aumento pronunciado que correspondía a la R tejido límite visible. El encajamos una función sigmoidal (por ejemplo, la función de Boltzmann) para el perfil de intensidad radial promediada y se utiliza su punto de inflexión (también conocido como x 0) como una definición de R. El correspondiente dos-pHoton microangiography (Texas-rojo) reveló la sección transversal de un vaso sanguíneo solitario central en el centro del cilindro. El diámetro del vaso sanguíneo central puede aplicarse directamente para determinar r.
Dos fotones de NADH imágenes proporciona la misma resolución espacial como la concurrente de alta resolución de imagen de la microangiography cortical. Una característica importante para la aplicación cuantitativa de este método es que p 50 del aumento de fluorescencia de NADH se ha medido a ser de 3,4 ± 0,6 mm de Hg 1 y que la intensidad de fluorescencia de NADH como una función del tejido microrregional PO 2 puede ser matemáticamente descrito con una función sigmoidal. . Se demuestra que esta técnica permite una para identificar las áreas del cerebro que son más vulnerables a la hipoxia (por disminución del contenido de oxígeno en el aire a 10%). También se muestra que la difusión de oxígeno sigue un patrón simple perivascular geométrica.
Un críticoiCal paso para este método es la calidad de la preparación ventana craneal. La cirugía debe producir un daño mínimo a fin de no perturbar el flujo sanguíneo a la zona expuesta. Una preocupación es que en una preparación quirúrgicamente comprometida, la corteza debajo de la ventana puede ser hipóxico, para empezar, lo que impide cualquier experimentos significativos. Una ventana craneal bien preparado debe tener intactos los vasos sanguíneos mayores y menores, con el flujo de sangre viva en todos los tipos de buques y no hay hemorragia significativa a lo largo de los bordes. En condiciones normoxic (PaO 2 80-100 mmHg, Sp. O2 97-99%) el parénquima cerebral que presentan fluorescencia uniforme, homogénea y sin NADH parches conspicuos, los tejidos brillantes con fluorescencia de NADH elevado.
Una restricción física fundamental de nuestro enfoque se limita la profundidad de penetración. La fluorescencia azul-verde de NADH en el cerebro es rápidamente atenuada por la absorción de la hemoglobina y la dispersión del tejido en estas longitudes de onda. Incluso con apertura numérica alta (por ejemplo 1,05) aguaobjetivos de inmersión de dos fotones NADH imagen se limita actualmente a las capas corticales I y II. Esta limitación es científicamente relevante porque el metabolismo energético en o en la proximidad de la materia blanca es probable que difieren de la materia gris. Sin embargo, la investigación de las estructuras corticales profundas, tales como capas IV-VI o estructuras subcorticales tales como tractos de sustancia blanca o cuerpo estriado del requeriría el uso de microlentes especializados como se describe en la corteza del ratón in vivo 6.
NADH basado en la medición de los límites de la difusión de oxígeno puede ser especialmente útil cuando se combina con otras mediciones tales como análisis de hiperemia funcional, y la detección de las tasas de flujo capilar 7. Por ejemplo, esta técnica se puede adaptar para visualizar la hipoxia en el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Alzheimer (EA) modelos. La geometría simple de difusión de oxígeno permite predecir el gradiente de oxígeno en los lechos microvasculares en circunstancias donde la densidad capilar es deaumentó 8 (por ejemplo, AD 9) y para examinar si las regiones de tejido cerebral con reducción de la densidad capilar tienen un mayor riesgo de daños debido a la hipoxia microstrokes. La capacidad de imagen microregionally también permite una para examinar la geometría y el tamaño de microstrokes tejido y determinar el volumen de tejido en el que se produce la hipoxia, así como la relación entre la hipoxia del tejido y posterior muerte neuronal o remodelación capilar 10.
Por último, dado el aumento de la fluorescencia endógena NADH son la consecuencia directa de la disfunción mitocondrial aguda, este método crea la oportunidad de utilizar imágenes de NADH como un reportero en particular para el metabolismo energético neuronal 11 y un proxy para la disfunción mitocondrial.
En conclusión, de dos fotones de imágenes de fluorescencia de NADH endógeno es una herramienta sencilla, poco exigente que se puede utilizar para comprender el aporte de oxígeno y el consumo en el cerebro en tanto normalesy en estados patológicos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Maiken Nedergaard (Universidad de Rochester Medical Center) para el diseño de la placa de la cabeza. El trabajo ha sido financiado por el NIH premios a SD (R01DA026325 y P30AI078498 y donaciones de fundaciones a KK (DANA cerebro bases y el programa de Immunoimaging, Asociación Americana del Corazón y la Asociación 0635595T ELA [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |