نحن هنا وصف طريقة لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة في القشرة الماوس<em> في الجسم الحي</em>. لأنه يقوم على التصوير ثنائي الفوتون المتزامنة من الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد (NADH) ودوران الأوعية الدقيقة القشرية. هذه الطريقة مفيدة لتحليل قرار عالية من الأوكسجين الأنسجة.
قدرة الدماغ على العمل بمستويات عالية من الطلب على التمثيل الغذائي يعتمد على امدادات الاوكسجين المستمر من خلال تدفق الدم والأنسجة انتشار الأوكسجين. هنا نقدم لبروتوكول تصور التجريبية والمنهجية لتصور مباشرة microregional نقص الأكسجة الأنسجة والاستدلال التدرجات الأوكسجين حول الوعاء في القشرة الماوس. لأنه يقوم على العلاقة غير الخطية بين الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد (NADH) كثافة مضان الداخلية وضغط الأكسجين الجزئي في الأنسجة، حيث لوحظ الأنسجة NADH مضان يزيد بشكل مفاجئ في مستويات الأكسجين في الأنسجة أقل من 10 مم زئبق 1. نحن نستخدم اثنين من الفوتون الإثارة في 740 نانومتر الذي يسمح لإثارة المتزامنة من جوهري مضان الأنسجة NADH وبلازما الدم يتناقض مع تكساس الأحمر ديكستران. مزايا هذه الطريقة على النهج القائمة تشمل ما يلي: أنه يستفيد من إشارة الأنسجة الذاتية ويمكن أن يؤديها باستخدام معيار ثنائي الفوتون في الدردشة الحيةالشيخوخة المعدات، ويسمح المراقبة المستمرة في المجال الكامل للرأي مع قرار عمق ميكرون 50 ~. علينا أن نبرهن على مناطق أبعد من أنسجة المخ الأوعية الدموية الدماغية تتوافق مع مناطق مستجمعات المياه الضعيفة التي هي الاولى لتصبح ميتة وظيفيا في أعقاب انخفاض نسبة الأوكسجين في الأوعية الدموية. هذا الأسلوب يسمح لأحد أن الأوكسجين صورة القشرية microregional وبالتالي فهو مفيد للنظر في دور غير كافية أو تقييد امدادات الاوكسجين في الأنسجة الأمراض الوعائية العصبية والسكتة الدماغية.
ارتفاع القرار المكانية معلومات حول انتشار الأوكسجين المهم لفهم كيفية تنظيم تدفق الدم في الدماغ لتوفير الأوكسجين إلى خلايا المخ، وتلبية الطلب الأيض. التقليدية قياسات الأكسجين البولاروجرافي باستخدام أقطاب الزجاج كلارك على غرار هي الغازية للغاية ويكون القرار المكانية منخفضة 2-3 و كبيرة (مجموعة 2) زمن الاستجابة. حتى الآن الدولة الوحيدة غير الغازية طريقة لقياس ص 2 في أنسجة المخ تروي تفسفر، حيث يبلغ معدل تسوس لجنة التحقيق متحمس يتناسب مع تركيز الأكسجين 4. هذه الطريقة توفر تركيزات الأكسجين دقيقة، ولكن يتطلب صبغة الملكية ومتطورة تقنيا التصوير عمر نظام تفسفر. هنا، نحن يبرهن على وجود بسيط، بساطة النهج الذي يمكن أن تجرى على نظام معيار التصوير ثنائي الفوتون مع قناتين flurescence. نهجنا يستفيد من إشارة الأنسجة الجوهرية 5 (أ)الثاني يتطلب سوى تصور مغاير للدوران الأوعية الدقيقة القشرية. نظرا للزيادة، غير الخطية الثنائية أساسا من مضان NADH في الحد من وظيفيا تركيزات الأكسجين 1، زيادة جوهرية NADH مضان ويلاحظ فقط في المناطق التي توجد فيها نقص الأكسجة أيضي كبير، مما يحد. ملمحة المهم هو أن يتم ملاحظتها مباشرة الحدود الأنسجة من انتشار الأوكسجين من microvessels القشرية بسبب التغيرات شدة على شكل cylindrically من مضان NADH الذاتية. نشير إلى هذه الهياكل واسطوانات كروغ، لأنه تم عرض مفهوم هياكل على شكل cylindrically التي تحدد حجم الاوكسيجين من الأنسجة المحيطة بها وعاء دموي من قبل كروغ أغسطس ولقد تم في الآونة الأخيرة لوحظ تجريبيا باستخدام اثنين من الفوتون NADH التصوير 1. ويمكن جمع كروغ اسطوانات الصور في 3D من خلال اتخاذ Z-كومة من إطارات الصور. فهي بارزة خصوصا في المناطق القريبة من الشرايين اختراق وهم خفة دم مطابقح الشعرية المنضب محيط بالشرين الأنسجة اسطوانات 1،4.
لتقديم تقرير موضوعي للR الأنسجة كروغ دائرة نصف قطرها أسطوانة (انظر القسم 5.2) ونحن على قياس كثافة بكسل شعاعي القيم داخل شريحة واضحة المعالم بين مركز الاسطوانة والحدود الخارجية باستخدام وظيفة مطلب "improfile". وينبغي اختيار الحدود الخارجية للقطاع لتمديد مع هامش أمان خارج حدود مرئية. لتحسين مستوى إشارة إلى الضجيج averageed نحن على جميع الخطوط الشعاعية اللازمة لتغطية الجزء المرئي الاسطوانة في الخطوات رقم 1. أظهر الناتج الملف متوسط كثافة شعاعي داخل قطعة زيادة حادة والتي تتوافق مع R الأنسجة حدود واضحة. ونحن تناسب وظيفة السيني (على سبيل المثال بولتزمان وظيفة) إلى الوضع كثافة شعاعي المتوسط وتستخدم نقطة انعطاف (المعروف أيضا باسم س 0) كتعريف للبحث. في المقابل 2-Pوكشفت hoton microangiography (تكساس الحمراء) في المقطع العرضي وعاء دموي مركزي الانفرادي في مركز الأسطوانة. ويمكن القطر من الأوعية الدموية المركزية تطبيقها مباشرة لتحديد ص.
ثنائي الفوتون NADH التصوير يوفر نفس القرار المكانية والتصوير ذات الدقة العالية المتزامنة للmicroangiography القشرية. ميزة هامة لتطبيق الكمي لهذا الأسلوب هو أنه تم قياس ص 50 من الزيادة في مضان NADH أن يكون من 3.4 ± 0.6 ملم زئبق (1) والتي يمكن أن كثافة NADH مضان بوصفها وظيفة من الأنسجة microregional ص 2 صفها رياضيا مع وظيفة السيني. . نظهر أن هذا الأسلوب يسمح احد لتحديد مناطق الدماغ التي هي الأكثر عرضة لنقص الأكسجة (من خلال خفض محتوى الأوكسجين في الهواء الى 10٪). علينا أن نبين أن انتشار الأوكسجين يتبع نمط بسيط حول الوعاء هندسية.
واحد الحرجةخطوة كال لهذا الأسلوب هو نوعية إعداد نافذة في الجمجمة. وينبغي لعملية جراحية إنتاج أضرار طفيفة حتى لا تعكر صفو تدفق الدم الى منطقة مكشوفة. والقلق هو أنه في التحضير للخطر جراحيا، والقشرة تحت النافذة قد تكون ميتة لتبدأ، ويحول دون أي تجارب ذات مغزى. وينبغي أن يكون نافذة معدة إعدادا جيدا في الجمجمة لديها سليمة الأوعية الدموية الرئيسية والثانوية مع تدفق الدم حية في جميع أنواع السفن وعدم وجود نزيف كبير على طول الحواف. في ظل ظروف normoxic (80-100 مم زئبق PaO2، SP O2 97-99٪) وينبغي لحمة الدماغ يحمل موحد، ومضان NADH متجانس من دون واضح، والبقع الأنسجة مشرق مع مضان NADH مرتفعة.
ويقتصر ومن بين القيود الأساسية المادية لنهجنا اختراق العمق. ومضان NADH الأخضر والأزرق في الدماغ هو الموهن بسرعة عن طريق امتصاص الهيموغلوبين والتشرذم في نسيج هذه الموجات. حتى مع فتحة عددية عالية (على سبيل المثال 1.05) للمياهأهداف غمر يقتصر حاليا اثنين من الفوتون NADH التصوير لأنني الطبقات القشرية والثاني. هذا القيد المختصة علميا لاستقلاب الطاقة في أو في القرب من المادة البيضاء سوف تختلف على الأرجح من المادة الرمادية. ومع ذلك، فإن التحقيق في الهياكل القشرية العميقة مثل السادس الى الرابع طبقات أو هياكل تحت القشرية مثل مساحات المادة البيضاء أو المخطط وتتطلب استخدام microlenses المتخصصة كما هو موضح في قشرة الماوس في الجسم الحي 6.
يمكن NADH مقرها قياس حدود انتشار الأوكسجين تكون مفيدة خصوصا عندما يقترن قياسات أخرى مثل تحليلات تبيغ وظيفي، والكشف عن معدلات تدفق شعري 7. على سبيل المثال، يمكن تكييف هذه التقنية لتصور نقص الأكسجة في السكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) نماذج. هندسة بسيطة من انتشار الأوكسجين يسمح لأحد أن يتنبأ التدرج الأوكسجين في سرير الاوعية الدموية الدقيقة تحت الظروف التي تكون فيها كثافة الشعيرات الدموية هي ديمجعد 8 (على سبيل المثال، م 9)، وإلى دراسة ما إذا كانت مناطق أنسجة المخ مع انخفاض الكثافة الشعرية هي في خطر متزايد للتلف بسبب نقص الأكسجة microstrokes. القدرة على صورة microregionally يسمح أيضا واحدة لدراسة الهندسة وحجم microstrokes الأنسجة وتحديد حجم الأنسجة التي يحدث نقص الأكسجة، وكذلك العلاقة بين نقص الأكسجة الأنسجة وموت الخلايا العصبية اللاحقة أو إعادة عرض شعري 10.
أخيرا، منذ زيادات في مضان NADH الذاتية هي نتيجة مباشرة لضعف الميتوكوندريا الحادة، وهذا الأسلوب يخلق الفرصة لاستخدام NADH التصوير كمراسلة محددة لاستقلاب الطاقة العصبية 11 وكيل لضعف الميتوكوندريا.
في الختام، واثنين من الفوتون التصوير من مضان NADH الذاتية هو بسيط، وأداة المتساهلة التي يمكن استخدامها لفهم تسليم الأوكسجين والاستهلاك في الدماغ على حد سواء تحت العاديوفي الولايات مرضية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور Maiken مايكين (جامعة روتشستر المركز الطبي) لتصميم الرأس لوحة. وقد تم دعم العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الجوائز إلى SD (R01DA026325 وP30AI078498 والمنح الأساس لKK (دانا أساس الدماغ وبرنامج Immunoimaging، جمعية القلب الأميركية 0635595T ورابطة ALS [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |