在这里,我们描述了一个方法,直接可视化在小鼠皮层microregional组织缺氧<em>在体内</em>。它是基于并发双光子成像烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和皮质微循环。这种方法是有用的组织供氧的高分辨率分析。
大脑的正常代谢需求的高层次的能力,取决于血流量和组织氧扩散通过连续供氧。在这里,我们提出了一个可视化的实验和方法的协议,直接可视化microregional组织缺氧,并推断在小鼠大脑皮层血管周围的氧气梯度。它是基于非烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的内源性荧光强度和氧在组织中,在那里观 察组织NADH的荧光突然增加组织的氧含量低于10毫米汞柱1分压之间的线性关系。在740 nm处NADH的内在组织与得克萨斯州红葡聚糖的荧光和对比血浆的同时激发允许我们使用双光子激发。这种方法比现有方法的优点包括以下内容:需要一种内在的组织信号的优势,可以在体内 IM使用标准的双光子设备老化,它允许在整场〜50微米的深度分辨率的连续监测。我们表明,脑组织,脑血管最远对应脆弱集水区,这是第一次成为功能缺氧后血管供氧下降。这种方法允许一个图像microregional皮质氧合,因此,用于检查神经血管疾病和中风的氧气供应不足或限制组织的作用。
有关氧气扩散的高空间分辨率信息,重要的是了解如何在大脑的血流量调节脑细胞提供氧气,以满足代谢的需求。传统克拉克式玻璃电极的极谱氧测量高度侵袭性和空间分辨率低2-3和范围显着(第二)的响应时间。到目前为止,唯一的非侵入性方法测量脑组织中的PO 2燐光猝灭,激发探头的衰减率是成正比的氧气浓度4。这种方法提供了精确的氧气浓度,但需要一个专用的染料和技术上先进的磷光寿命成像系统。在这里,我们展示了一个简单的,简单的方法,可以在一个标准的双光子成像系统进行有两个flurescence通道。我们的方法需要一种内在的组织信号5的优势第二只需要对比的皮质微循环的可视化。由于非线性,基本上二进制增加NADH的荧光,在功能限制氧气浓度1,增加内在NADH的荧光观察,仅在显着,新陈代谢限制缺氧地区。一个重要的含义是,从皮质微血管的氧气扩散的组织界限,直接由圆柱形的内源性NADH的荧光强度的变化观察。我们是指这些结构作为克罗缸,因为定义周围血管组织的含氧体积的圆柱状结构的概念是由八月克罗最近已经利用双光子成像1 NADH的实验观察。克罗气瓶的图像可以被收集在3D一帧图像的Z-Stack。他们穿透动脉附近尤其突出,他们符合机智Ĥ毛细血管耗尽periarteriolar组织气瓶1,4。
提供克罗组织缸半径为R的客观测定(见5.2节),我们之间的气缸中心和外部边界使用MATLAB函数“improfile”定义段内测量其径向像素强度值。段外边界应选择延长与超越有形的边界的安全保证金。为了提高信号的噪音水平,我们averageed需要支付1°气缸可见段所有径向线。段内产生的平均径向强度分布呈现急剧增加,这相当于有形的组织边界 r。我们适合sigmoidal函数(如波兹曼函数)的平均径向强度分布,并用其拐点(又称X 0)为R 的定义。对应的两个-P华庭时尚商务microangiography(得克萨斯红)揭示了一个孤独的气缸中心的中央血管的横截面。中央血管的直径,可直接应用于确定ŕ。
并发高分辨率成像的皮质microangiography的双光子NADH的成像提供相同的空间分辨率。这种方法的定量化应用的一个重要特点是,磷的NADH荧光增加50已测得的3.4±0.6毫米汞柱和PO 2 microregional组织功能的NADH荧光强度可以用数学描述sigmoidal函数。 。我们表明,这种技术允许一个确定大脑缺氧(空气中的氧气含量降低10%)是最脆弱的地区。我们还表明,氧气扩散如下一个简单的几何血管周围模式。
一击ICAL此方法的步骤是颅窗口准备的质量。手术应产生最小的损伤,为了不惊动血流暴露面积。一个值得关注的是,在手术妥协的准备,窗下的皮层可能是缺氧开始,排除任何有意义的实验。一个精心准备的颅窗,应该有完整的主要和次要的血管,在所有船种生动的血流量和沿边缘没有明显的出血。常氧条件下(氧分压80-100毫米汞柱,SP氧气97-99%),脑实质表现不突出,明亮的组织补丁NADH的荧光升高均匀,均匀NADH的荧光。
我们的方法的一个基本的物理约束是有限的穿透深度。在脑的蓝绿色NADH的荧光是由血红蛋白在这些波长的吸收和散射组织迅速衰减。即使是用高数值孔径(如1.05)的水浸泡目标双光子NADH的成像目前仅限于皮质层I和II。这种限制是科学,因为能源或邻近白质的代谢有关,可能会不同于灰质。然而,如层IV-VI或皮层下结构,如白质束或纹状体深皮层结构的调查,将需要使用专门的微透镜在小鼠皮层体内6。
NADH基于氧气的扩散边界的测量与分析功能充血,毛细血管通量率检测7,如其他测量相结合时,特别有用。例如,这种技术可适应缺氧,在中风和阿尔茨海默氏病(AD)模型可视化。氧气扩散的简单的几何形状允许一个预测的情况下,毛细血管密度是氧气在微血管床梯度8折痕(例如,公元9),并检查是否与脑组织毛细血管密度降低地区微振由于缺氧损伤的风险增加。图像的能力microregionally还允许一个研究组织微振的几何形状和大小,确定缺氧发生在该组织的体积,以及之间的关系,组织缺氧和随后的神经元死亡或毛细管重塑10。
最后,由于增加内源性NADH的荧光急性线粒体功能障碍的直接后果,这种方法创造了机会,利用NADH的成像作为一个特定的神经能量代谢和线粒体功能障碍的代理记者。
总之,内源性NADH的荧光双光子成像是一种简单,要求不高的工具,可以用来了解在正常的大脑中的氧气输送和消费在病理状态。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢头板设计博士,Nedergaard Maiken(罗切斯特大学医学中心)。这项工作已经由NIH奖项支持SD(R01DA026325和P30AI078498和基金会的资助KK(德纳基础脑和Immunoimaging计划,美国心脏协会0635595T和ALS协会[#1112)])。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |