Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do rato<em> In vivo</em>. Baseia-se na imagem de dois fotões concomitante de dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) e da microcirculação cortical. Este método é útil para a análise de alta resolução de fornecimento de oxigénio do tecido.
A capacidade do cérebro para funcionar a níveis elevados de demanda metabólica depende de suprimento contínuo de oxigênio através do fluxo sanguíneo e difusão de oxigênio nos tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo experimental visualizados e metodológico para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional e inferir gradientes de oxigênio perivasculares do córtex mouse. Baseia-se a relação não linear entre dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) intensidade de fluorescência endógena e da pressão parcial de oxigénio no tecido, onde o tecido observadas NADH fluorescência aumenta abruptamente a níveis de tecidos de oxigénio abaixo de 10 mmHg 1. Nós usamos dois fótons excitação a 740 nm que permite a excitação concomitante de fluorescência intrínseca tecido NADH e plasma sanguíneo em contraste com Texas Red-dextran. As vantagens deste método sobre as abordagens actuais incluem o seguinte: leva vantagem de um sinal de tecido intrínseca e pode ser realizada usando o padrão de dois fotões in vivo imenvelhecimento equipamento, que permite a monitorização contínua em todo o campo de visão com uma resolução de profundidade de aproximadamente 50 um. Nós demonstramos que as áreas cerebrais de tecido mais afastadas dos vasos sanguíneos cerebrais correspondem a áreas de mananciais vulneráveis que são os primeiros a tornar-se funcionalmente hipóxica após um declínio na oferta de oxigênio vascular. Este método permite a oxigenação imagem microrregional cortical e, portanto, útil para examinar o papel da alimentação inadequada ou restrito de oxigênio nos tecidos em doenças neurovasculares e derrames.
Informações de alta resolução espacial sobre a difusão do oxigênio é importante para entender como o fluxo de sangue no cérebro é regulado para fornecer oxigênio para as células cerebrais, e para atender à demanda metabólica. Tradicionais medições de oxigênio polarografia utilizando eletrodos de Clark estilo de vidro são altamente invasivos e têm baixa resolução espacial 2-3 e tempo de resposta significativa (segunda faixa). Até agora, o método não invasivo apenas para medir a pO 2 no tecido cerebral é têmpera fosforescência, onde a taxa de decomposição da sonda animado é proporcional à concentração de oxigénio 4. Este método proporciona concentrações de oxigênio precisos, mas requer um corante de propriedade e um sofisticado sistema de imagens tecnicamente fosforescência vida. Aqui, nós demonstrar uma abordagem direta e simples que podem ser realizados em um sistema de imagem padrão de dois fótons com dois canais flurescence. Nossa abordagem tira proveito de um sinal de tecido intrínseco 5 and só requer visualização contrastante da microcirculação cortical. Devido ao aumento não-linear, essencialmente binária de NADH fluorescência a funcionalmente limitando concentrações de oxigénio 1, o aumento da fluorescência intrínseca NADH é observada apenas em áreas com significativo, hipoxia metabolicamente limitante. Uma implicação importante é que os limites de tecido de difusão de oxigênio a partir de microvasos corticais são diretamente observáveis por mudanças de intensidade de fluorescência de forma cilíndrica NADH endógeno. Referimo-nos a estas estruturas como as garrafas de Krogh, porque o conceito de estruturas de forma cilíndrica que definem o volume oxigenado de tecido circundante de um vaso sanguíneo foi introduzido por agosto Krogh e foi recentemente observada experimentalmente usando dois fotões NADH imagem 1. Imagens cilindros Krogh podem ser coletadas em 3D, tendo uma pilha z-de quadros de imagem. Eles são especialmente proeminente na vizinhança das arteríolas penetrantes e eles são wit congruenteh capilar esgotados cilindros 1,4 tecidos periarteriolares.
Para proporcionar uma determinação objectivo do raio R Krogh tecido do cilindro (ver Secção 5.2) foram medidos os seus valores de intensidade de pixel radiais dentro de um segmento bem definida entre o centro do cilindro e do limite exterior usando a função de Matlab "improfile". O limite exterior do segmento deve ser escolhido para estender com uma margem de segurança para além do limite visível. Para melhorar o nível de sinal-para-ruído que averageed sobre todas as linhas radiais necessários para cobrir o segmento de cilindro visível em passos de 1 °. O resultante perfil de intensidade média radial dentro do segmento exibiram um aumento acentuado que correspondia ao R visível do tecido de limite. O que se encaixam uma função sigmoidal (por exemplo, a função de Boltzmann) para o perfil de intensidade média radial e utilizou o seu ponto de inflexão (também conhecido como x 0) como uma definição de R. O correspondente dois-pHoton microangiography (Texas-vermelho) revelou a secção transversal de um vaso sanguíneo central solitário no centro do cilindro. O diâmetro do vaso sanguíneo central pode ser aplicada directamente para determinar r.
Dois fótons NADH imagem fornece a mesma resolução espacial que a imagem de alta resolução simultânea do microangiography cortical. Uma característica importante para a aplicação quantitativa deste método é que p 50 do aumento de fluorescência de NADH foi medido como sendo de 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 e que a intensidade de fluorescência de NADH como uma função do tecido microrregional pO 2 pode ser descrito matematicamente com uma função sigmoidal. . Nós mostramos que esta técnica permite um para identificar áreas do cérebro que são mais vulneráveis a hipoxia (diminuindo o teor de oxigénio no ar a 10%). Mostramos também que a difusão do oxigênio segue um padrão perivascular geométrica simples.
Um critpasso ical para este método é a qualidade da preparação janela craniana. A cirurgia deve produzir danos mínimos de modo a não perturbar o fluxo sanguíneo para a área exposta. Uma preocupação é que, em uma preparação cirurgicamente comprometida, o córtex sob a janela pode ser hipóxico para começar, impedindo qualquer experiências significativas. Uma janela bem preparado craniana deve ter intactas vasos sangüíneos maiores e menores, com fluxo de sangue vivo em todos os tipos de navios e sem sangramento significativo ao longo das bordas. Sob condições de normóxia (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%), o parênquima cerebral deve apresentar uniforme, homogênea, sem fluorescência NADH conspícuos, retalhos de tecidos brilhantes com fluorescência NADH elevada.
A restrição física fundamental de nossa abordagem é limitada profundidade de penetração. O azul-verde de fluorescência de NADH no cérebro é rapidamente atenuada pela absorção de hemoglobina e de espalhamento do tecido a estes comprimentos de onda. Mesmo com abertura numérica elevada de água (por exemplo, 1,05)objetivas de imersão de dois fótons NADH imagem está actualmente limitada a cortical camadas I e II. Esta limitação é cientificamente relevante porque o metabolismo da energia no, ou em proximidade à matéria branca provavelmente diferem de matéria cinzenta. No entanto, a investigação de profundas estruturas corticais tais como camadas IV-VI ou estruturas subcorticais tais como tratos de substância branca ou o corpo estriado exigiria a utilização de microlentes especializadas, tal como descritos no córtex do rato in vivo 6.
NADH baseado medição dos limites de difusão de oxigénio pode ser especialmente útil quando combinado com outras medições, tais como as análises de hiperemia funcional, e detecção de taxas de fluxo capilar 7. Por exemplo, esta técnica pode ser adaptado para visualizar hipoxia em acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) modelos. A geometria simples de difusão de oxigénio permite prever o gradiente de oxigénio em leitos microvasculares em circunstâncias em que a densidade capilar é devincado 8 (por exemplo, AD 9) e para examinar se as regiões cerebrais de tecido com densidade capilar reduzida estão em risco aumentado de dano devido à hipóxia microstrokes. A capacidade de imagem microregionally também permite que um para examinar a geometria e tamanho de microstrokes de tecido e de determinar o volume de tecido no qual ocorre a hipóxia, bem como a relação entre a hipóxia tecidual e subsequente morte neuronal ou remodelação capilar 10.
Finalmente, uma vez que aumentos de fluorescência NADH endógeno são a conseqüência direta da disfunção mitocondrial aguda, esse método cria a oportunidade de usar imagens de NADH como repórter específico para o metabolismo de energia neural 11 e um proxy para a disfunção mitocondrial.
Em conclusão, dois fotões de imagem de fluorescência de NADH endógena é uma ferramenta simples, pouco exigente que pode ser usado para compreender a entrega de oxigénio eo consumo no cérebro sob tanto normaise nos estados patológicos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) para o design da placa cabeça. O trabalho foi suportado por concessões do NIH para SD (R01DA026325 e P30AI078498 e subsídios da Fundação para o KK (DANA Cérebro fundação e programa Immunoimaging, American Heart Association 0635595T ea Associação ALS [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |