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Biology

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Published: February 20, 2012
doi:
10.3791/3416
, , , , ,
1Department of Molecular Carcinogenesis and Center for Cancer Epigenetics,University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, 2Department of Cell Biology,Poznan University of Medical Sciences, 3Department of Molecular Biology,The Scripps Research Institute

Summary

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

Abstract

여기에 우리가 1-3 나트륨 butyrate의 면전에서 Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 retroviral 벡터를 사용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC)로 인간 성인 섬유아 세포를 프로그래밍의 프로토콜을 제시한다. 우리는 늦게까지 통로를 재설정하는 데이 방법을 사용 (> p10) Friedreich 운동 실조증 환자에서 파생된 인간의 성인 섬유아 세포 (GM03665, Coriell 리포지 토리). 프로그래밍 접근 방식은 바이러스를 함유 미디어의 면전에서 섬유아 세포의 반복적인 원심 분리를 사용하여 고효율 형질 도입 프로토콜을 포함한다. 다시 프로그램 hiPSC의 식민지가 Tra-1-81 실시간으로 immunostaining를 사용하여 확인되었다 pluripotent 세포 표면 마커가 아닌 다시 프로그램 섬유아 세포에서 분리하고 수동 4,5 passaged. 이러한 hiPSC 그런 다음 Matrigel 접시에 양도하고 직접 프로그래밍을 접시에서, 피더없는 조건에서 재배되었다. 첫 번째 통로부터는 hiPSC의 식민지는 hES – 내가 특성 입증IKE 형태. 이 프로토콜을 사용하여 선택한 식민지 이상의 70 %는 성공적으로 확장과 셀 라인으로 작성할 수도 있습니다. 설립 hiPSC 라인 표면 마커 TRA-1-60 SSEA-4뿐만 아니라 핵 마커 Oct3 / 4, Sox2와 Nanog 포함하여 특색있는 pluripotency 마커를 표시합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 설립 Friedreich 운동 실조증 환자 및 제어 개인 6, 인간의 신생아 섬유아 세포뿐만 아니라, 인간 keratinocytes에서 얻은 성인 섬유아 세포를 사용하여 테스트되었습니다.

Protocol

1. 바이러스 생산과 형질 도입 DMEM 배지 (DMEM 높은 포도당, inactivated 10% FBS 열, 2 개의 MM L-글루타민, 아니 항생제)의 10 ML에서 ~ 7-8×10과 6 당 10cm 판의 밀도에 플레이트 피닉스 Ampho 세포. 37 야간 보육 및 문화 플레이스 ° C에서 5 % CO 2. 12 벡터 인코딩 μg 중 Oct3 / 4, Sox2, Klf4, C-myc, 또는 GFP 유전자 (Addgene plasmids 17,217, 17,218, 17,219, 17,220) 35 μl Fugene 6.를 사용하여 다음 날 transfect…

Discussion

특히 신경 및 neurodegenerative 인간의 질병, 유학, 특히 충분한 사람 세포 모델의 어려움으로 인해 도전되었습니다. 다양한 세포 유형으로 그들을 차별 유도된 pluripotent 줄기 세포의 가능성에 쉽게 얻을 체세포를 재설 정할 능력은 유전 질병 세포 모델을 만들 수있는 가능성을 열었습니다. 또한, iPSCs은 재생 의료의 미래에 큰 약속을 누르고 있습니다. 따라서 pluripotency로 체세포를 프로그래밍의 안정?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 Friedreich 운동 실조증 연구 얼라이언스과 아놀드 가족 재단과 줄기 세포 및 MD 앤더슨 암 센터에서 발달 생물학을위한 센터에서 시범 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Reagent Company Catalog number
DMEM Invitrogen 11965
DMEM/F12 Invitrogen 11330
KSR Invitrogen 10828
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140
Sodium butyrate Sigma B5887
Y27632 Stemgent 04-0012
bFGF Stemgent 03-0002
Tra-1-81 antibody Stemgent 09-0069
Oct3/4 antibody Santa Cruz sc-8628
Nanog antibody Cell Signaling Technology 4903S
Tra-1-60 antibody Millipore MAB4360
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579S
SSEA4 Millipore MAB4304
CF1 MEFs Globalstem GSC-6201G
Objective marker Nikon MBW10010
Matrigel BD Biosciences 354277
mTeSR1 StemCell Technologies 05850
β-mercaptoethanol Sigma M7522
Fugene 6 Roche 11814443001
polybrene Sigma H9268
Object marker Nikon MBW10010
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References

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SelectingIsolatingColoniesHuman Induced Pluripotent Stem CellsReprogrammingAdult FibroblastsRetroviral VectorsOct3/4Sox2Klf4C-mycSodium ButyrateEfficient Transduction ProtocolVirus-containing MediaLive ImmunostainingTra-1-81Pluripotent CellsManually PassagedMatrigel PlatesFeeder-free ConditionsHES-like MorphologyExpansionCell LinesPluripotency MarkersTRA-1-60SSEA-4Oct3/4Sox2Nanog

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Polak, U., Hirsch, C., Ku, S., Gottesfeld, J., Dent, S. Y., Napierala, M. Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts. J. Vis. Exp. (60), e3416, doi:10.3791/3416 (2012).
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