Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti
Summary
Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.
Abstract
Qui presentiamo un protocollo di riprogrammazione fibroblasti umani adulti in cellule pluripotenti indotte umane staminali (hiPSC) utilizzando vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) in presenza di sodio butirrato 1-3. Abbiamo usato questo metodo per riprogrammare il passaggio in ritardo (> p10) fibroblasti umani adulti ottenuti da paziente l'atassia di Friedreich (GM03665, Coriell Repository). L'approccio riprogrammazione comprende protocollo trasduzione altamente efficiente mediante centrifugazione ripetitivo di fibroblasti in presenza di virus contenenti supporti. Le colonie hiPSC riprogrammate sono stati identificati usando immunostaining dal vivo per Tra-1-81, un marcatore di superficie delle cellule pluripotenti, separato da fibroblasti non riprogrammate e manualmente diversi passaggi 4,5. Questi hiPSC state poi trasferite in piastre Matrigel e coltivate in condizioni prive di alimentazione, direttamente dalla piastra riprogrammazione. A partire dal primo passaggio, colonie hiPSC dimostrare caratteristica hES-lmorfologia ike. Usando questo protocollo più del 70% delle colonie selezionati può essere espansa con successo e stabilito in linee cellulari. Le linee stabilite hiPSC visualizzata caratteristici marcatori pluripotenziali tra cui marcatori di superficie TRA-1-60 e SSEA-4, così come marcatori nucleari Oct3 / 4, Sox2 e Nanog. Il protocollo qui presentato è stato stabilito e testato utilizzando fibroblasti ottenuti da pazienti adulti Friedreich atassia e individui di controllo 6, fibroblasti umani neonati, nonché cheratinociti umani.
Protocol
Discussion
Studiare le malattie umane, in particolare neurologiche e neurodegenerative, è stata particolarmente difficile a causa l'inaccessibilità di adeguati modelli cellulari umani. La capacità di riprogrammare facilmente ottenibili cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte e la possibilità di differenziarle in tipi di cellule diverse ha aperto la possibilità di creare modelli cellulari di malattie genetiche. Inoltre, iPSCs tenere una grande promessa per il futuro della medicina rigenerativa. Pertanto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Alliance L'Atassia di Friedreich ricerca e una borsa di studio pilota da Arnold Family Foundation e il Centro per le cellule staminali e biologia dello sviluppo presso MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
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