אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.
במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול של תכנות מחדש fibroblasts בוגרים האדם אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) בנוכחות סודיום בוטיראט 1-3. השתמשנו בשיטה זו כדי לתכנת מחדש את המעבר מאוחר (> P10) fibroblasts בוגרים האדם הנגזרות של המטופל Friedreich אטקסיה (GM03665, Coriell Repository). הגישה תכנות מחדש כולל פרוטוקול התמרה היעילה ביותר באמצעות צנטריפוגה חוזרת של fibroblasts בנוכחות המכילים וירוסים התקשורת. המושבות hiPSC לתכנות מחדש זוהו באמצעות immunostaining חי עבור Tra-1-81, סמן פני השטח של תאים pluripotent, מופרד fibroblasts לא לתכנות מחדש ו passaged ידני 4,5. HiPSC אלה הועברו לאחר מכן צלחות Matrigel וגדלה במזין נטולי תנאים, ישירות מהצלחת תכנות מחדש. החל מ במעבר 1, מושבות hiPSC להפגין מאפיין הס-lאייק המורפולוגיה. שימוש בפרוטוקול זה יותר מ 70% של מושבות שנבחרו ניתן להרחיב בהצלחה והקים את שורות תאים. הקווים hiPSC שהוקמו מוצג סמנים אופייניים pluripotency כולל סמנים פני השטח tra-1-60 ו SSEA-4, כמו גם סמנים גרעיני Oct3 / 4, ו Sox2 Nanog. הפרוטוקול המובא כאן הוקם ונבדק באמצעות fibroblasts בוגרים שהתקבלו מחולים אטקסיה של Friedreich ויחידים בקרת 6, fibroblasts אדם שזה עתה נולדו, כמו גם קרטינוציטים אדם.
לימוד מחלות אנושיות, נוירולוגיות ניווניות במיוחד, כבר מאתגר במיוחד בשל חוסר נגישות של מודלים מתאימים הסלולר אדם. היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים להשגה בקלות לתוך המושרה בתאי גזע pluripotent ואת הפוטנציאל להבדיל אותם סוגי תאים שונים נפתחה האפשרות ליצור דגמים סלולריים של מ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי ברית אטקסיה המחקר של Friedreich ומענק טייס מן ארנולד קרן משפחת והמרכז בתאי גזע וביולוגיה התפתחותית ב MD Anderson Cancer Center.
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |