نقدم لبروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الجسدية من كفاءة الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) وتحديد hiPSC برمجتها بشكل صحيح عن طريق تلطيخ على الهواء مباشرة مع هيئة تنظيم الاتصالات 1-81 الأجسام المضادة.
هنا نطرح على بروتوكول إعادة برمجة الخلايا الليفية بالغ الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) في وجود الزبدات الصوديوم 1-3. استخدمنا هذه الطريقة لإعادة برمجة مرور في وقت متأخر (> P10) الليفية الكبار حقوق الإنسان مستمد من المريض رنح فريدريك (GM03665، Coriell مستودع). نهج إعادة برمجة وتشمل كفاءة عالية باستخدام بروتوكول تنبيغ الطرد المركزي المتكررة من الخلايا الليفية في حضور وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. وقد تم تحديد المستعمرات hiPSC برمجتها باستخدام المناعية الحية لترا-81-1، علامة سطح الخلايا المحفزة، وفصلها عن الخلايا الليفية غير برمجتها وpassaged 4،5 يدويا. ثم تم نقل هذه hiPSC لوحات Matrigel ونمت في ظروف التغذية، مجانا، مباشرة من لوحة إعادة برمجة. ابتداء من المقطع الاول، المستعمرات hiPSC شرح الخصائص HES-Lآيك التشكل. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أن أكثر من 70٪ من المستعمرات المختارة بنجاح موسع، وأنشأ في خطوط الخلايا. عرض خطوط أنشئت hiPSC علامات تعدد القدرات المميزة بما في ذلك علامات سطح TRA-1-60 و SSEA-4، فضلا عن علامات النووية Oct3 / 4، وSox2 Nanog. تم تأسيس بروتوكول المقدمة هنا واختبار باستخدام الخلايا الليفية الكبار التي تم الحصول عليها من المرضى رنح فريدريك والأفراد سيطرة 6، الليفية الوليد الإنسان، فضلا عن الخلايا الكيراتينية البشرية.
دراسة الأمراض التي تصيب الإنسان، والجهاز العصبي وخاصة الاعصاب، وقد تم الطعن على نحو خاص بسبب عدم إمكانية الوصول إلى نماذج كافية الخلوية الإنسان. افتتح والقدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية التي يمكن الحصول عليها بسهولة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها وإمك…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل تحالف فريدريك البحث رنح ومنحة رائدة من أرنولد العائلة المؤسسة ومركز الخلايا الجذعية وعلم الأحياء التنموي في مركز اندرسون للسرطان.
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |