כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.
גירויים חזותיים מזוהים והועברה על פני טווח דינמי רחב של עוצמות אור ושינויים תדירות על ידי נוירונים מתמחים הרשתית החולייתנים. שתי כיתות של נוירונים, קולטני האור ברשתית תאים דו קוטבית, לעשות זאת באמצעות סרט מסוג אזורים פעילים, המאפשרים שחרור הנוירוטרנסמיטר מתמשכת תפוקה גבוהה על פני תקופות זמן ארוכות. על סוג המעורבות דו קוטבית (MB) תא מסופי ברשתית דגי זהב, אשר depolarize לגירויים אור ולקבל מוט מעורבת קלט חרוט photoreceptor, מתאימים ללימוד סרט מסוג סינפסות הן בשל גודל גדול שלהם (~ 10-12 מיקרומטר קוטר) וכן קשרים סינפטיים רבים שלהם לרוחב והדדית עם דנדריטים תא amacrine. גישה ישירה מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב רשתית עם טכניקה טלאי-clamp מאפשר מדידת Ca presynaptic 2 + זרמים, קיבול שינויים קרום, משוב הדדי עיכוב סינפטי בתיווכו של GABA <תת> A ו-C קולטני GABA הביע על המסופים. Presynaptic קיבול הממברנה מדידות של exocytosis לאפשר אחד כדי ללמוד את הפלסטיות לטווח קצר של שחרור הנוירוטרנסמיטר מעוררים 14,15. בנוסף, גמישות לטווח הקצר ולטווח הארוך של שחרור נוירוטרנסמיטר מדכא מתאי amacrine יכול להיות גם נחקר על ידי הקלטות של עיכוב משוב הדדי להגיע למסוף Mb 21. במהלך פרקי זמן קצרים (למשל 10 ~ ים), משוב GABAergic עיכוב הדדי מתאי amacrine עובר לזווג הדופק דיכאון דרך דלדול בריכה GABA שלפוחית 11. הדינמיקה הסינפטי של הרשתית microcircuits בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית כך ניתן ללמוד באופן ישיר.
הטכניקה המוח פרוסה הוצג למעלה מ 40 שנה אבל הוא עדיין מאוד שימושי עבור חקירת התכונות החשמליות של נוירונים, הן סומה תא בודד, יחיד או דנדריט האקסון, ואת מ 'icrocircuit ברמה הסינפטית 19. רקמות כי הם קטנים מדי כדי להיות מודבק ישירות על גבי התא חיתוך לעיתים קרובות מוטבעים הראשון אגר (או להציב על גבי נייר פילטר) ופרוסים אז 20, 23, 18, 9. בסרטון הזה, אנו מעסיקים את הטכניקה מראש הטבעה אגר באמצעות הרשתית דגי זהב. חלק מסופי ענק דו קוטבית תא פרוסות שלנו הרשתית דגי זהב הם axotomized (האקסון לחתוך) במהלך ההליך חיתוך. זה מאפשר לנו לבודד אחד presynaptic מסוף תשומות עצב, כי הקלטה של מסופי axotomized כולל את האותות מתא סומה, דנדריטים. לחלופין, אפשר גם להקליט מתאי Mb שלמים דו קוטבית, על ידי הקלטה של מסופים המחוברים אקסונים שלא נותקו במהלך ההליך חיתוך. באופן כללי, השימוש בפרוטוקול זה הניסוי יסייעו לימודים של פיסיולוגית הסינפטי ברשתית, ניתוח Microcircuit פונקציונלי, שידור הסינפטי ב סינפסות סרט.
שלב קריטי וקשה בפרוטוקול שלנו היא העברת היצירה של הרשתית לתוך הפתרון אגר (פרוטוקול 3.4). יש צורך להסיר בזהירות את ההומור זגוגי פתרון פרוסה שיורית מן היצירה רשתית ולהעביר אותו ללא עיוות או כיפוף. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים מרית קטנה (21-401-25B, Fisherbrand) עם קצה כפוף לטו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר פרד Rieke הסבר מינו של הכנת אגר מוטבע-פרוסה רשתית כשהתחלנו באמצעות פרוטוקול במעבדה שלנו. אנו מודים גם לורי Vaskalis להמחשה של סכמטית סקירה בני הזוג. Veeramuthu Balakrishnan ו Soyoun צ'ו עבור הערות מועילות על טקסט ווידאו. עבודה זו נתמכה על ידי ניי-NIH RO1 מענק, והוא גם נתמך בחלקו על ידי קרן המחקר קוריאה גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה [KRF-2008-357-E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |