نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.
تم الكشف عن المثيرات البصرية ونقل أكثر من مجموعة واسعة ديناميكية من شدة الضوء وتيرة التغيرات التي الخلايا العصبية المتخصصة في شبكية الفقاريات. طبقتين من الخلايا العصبية للشبكية ، وخلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين ، وتحقيق ذلك عن طريق استخدام شريط من نوع المناطق النشطة ، والتي تتيح سرعة عالية مستمرة والافراج عن العصبي على مدى فترات زمنية طويلة. ON – نوع من الخلايا المختلطة بين القطبين (MB) محطات ذهبية في الشبكية ، مما يزيل الاستقطاب للمؤثرات الضوء وتلقي قضيب المختلط وإدخال المخروط مبصرة ، هي مناسبة لدراسة الشريط من نوع المشابك على حد سواء نظرا لحجمها الكبير (10-12 ~ قطرها ميكرون) ، وعلاقاتهم عديدة متشابك الأطراف ومتبادلة مع التشعبات الخلية عديم الاستطالات. الوصول المباشر إلى محطات ميغابايت القطبين في الخلية شرائح ذهبية الشبكية مع تقنية التصحيح ، المشبك يسمح قياس الكالسيوم قبل المشبكي 2 + التيارات والتغيرات السعة الغشاء ، وردود الفعل المتبادلة تثبيط متشابك بوساطة GABA <وأعرب الفرعي> مستقبلات GABA A و C على المحطات. قبل المشبكي قياسات السعة غشاء إيماس تسمح لأحد لدراسة اللدونة قصيرة الأجل لإطلاق ناقل عصبي مثير 14،15. بالإضافة ، يمكن أيضا اللدونة قصيرة الأجل وطويلة الأجل لإطلاق النواقل العصبية من الخلايا المثبطة يكون عديم الاستطالات التي حققت فيها تسجيلات لتثبيط ردود فعل متبادلة وصوله الى محطة ميجا 21. على مدى فترات قصيرة من الوقت (على سبيل المثال ~ 10 ق) ، وردود الفعل المتبادلة GABAergic تثبيط من خلايا عديمة المحوار يخضع إقران النبض الاكتئاب غابا عن طريق حويصلة استنفاد تجمع 11. وبالتالي يمكن لديناميات متشابك من رقائق في طبقة الشبكية ضفيري الداخلية للشبكية دراستها مباشرة.
تم إدخال تقنية شريحة الدماغ أكثر من 40 عاما لكنها ما زالت مفيدة جدا للتحقيق في الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية ، سواء على سوما خلية واحدة ، تغصن واحد أو محور عصبي ، ومicrocircuit مستوى متشابك 19. وغالبا ما تكون الأنسجة التي هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن لصقها مباشرة على غرفة تشريح مضمن الأولى في أجار (أو وضعها على ورقة فلتر) وشرائح ثم 20 ، 23 ، 18 ، 9. في هذا الفيديو ، ونحن توظيف تقنية آغار قبل التضمين باستخدام الشبكية ذهبية. وaxotomized بعض المحطات العملاقة في القطبين خلية لدينا شرائح للشبكية ذهبية (محوار قطع) خلال إجراء تشريح. وهذا يسمح لنا محطة واحدة لعزل العصب قبل المشبكي المدخلات ، وذلك لأن التسجيل من المحطات axotomized يستبعد إشارات من المقصورة ، سوما شجيري. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أيضا تسجيل خلايا سليمة من القطبين ميغابايت ، من خلال تسجيل من محطات ملحقة المحاور التي لم يتم خفض أثناء إجراء تشريح. عموما ، سوف تستخدم هذا البروتوكول التجريبي المساعدات في دراسات علم وظائف الأعضاء متشابك شبكية العين ، والتحليل الوظيفي المتناهية الصغر ، وانتقال متشابك في نقاط الاشتباك العصبي الشريط.
وثمة خطوة حاسمة وصعبة في بروتوكول لدينا هو نقل قطعة من شبكية العين في حل آغار (بروتوكول 3.4). فمن الضروري إزالة بعناية والفكاهة الزجاجي حل شريحة المتبقية من قطعة الشبكية ونقلها دون تحريف أو الانحناء. من أجل تحقيق هذا الهدف ، ونحن نستخدم ملعقة صغيرة (21 – 401 – 25B ، Fis…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور فريد Rieke لتفسير الرقيقة للأجار جزءا لا يتجزأ من إعداد شريحة الشبكية عندما بدأنا باستخدام بروتوكول في مختبرنا. كما نشكر لوري Vaskalis لتوضيح نظرة تخطيطية والدكاترة. Veeramuthu بالاكريشنان وتشو Soyoun للحصول على تعليقات مفيدة حول النص والفيديو. وأيد هذا العمل عن طريق منحة RO1 NEI – NIH ، وكان أيضا دعما جزئيا من خلال منحة مؤسسة كوريا للبحوث التي تمولها الحكومة الكورية [KRF – 2008 – 357 – E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |