Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.
Visuele prikkels worden gedetecteerd en getransporteerd over een breed dynamisch bereik van lichtintensiteiten en frequentie veranderingen door gespecialiseerde neuronen in de gewervelde netvlies. Twee klassen van retinale neuronen, fotoreceptoren en bipolaire cellen dit doen door gebruik ribbon-type actieve zones, waarvoor aanhoudende en high-throughput vrijkomen van neurotransmitters kunnen over langere periodes. ON-type gemengde bipolaire cel (Mb) terminals in de goudvis netvlies, die depolariseren aan het licht stimuli en te ontvangen gemengde staafjes en kegeltjes fotoreceptor inbreng, zijn geschikt voor de studie van de lint-type synapsen zowel vanwege hun grote omvang (~ 10-12 um diameter) en hun talrijke laterale en wederzijdse synaptische verbindingen met amacrine cel dendrieten. Directe toegang tot Mb bipolaire cel terminals in goudvissen netvlies plakken met de patch-clamp techniek maakt het mogelijk de meting van het presynaptische Ca 2 + stromingen, membraan capaciteit verandert, en wederzijdse feedback synaptische inhibitie gemedieerd door GABA <sub> A en GABA C-receptoren tot expressie gebracht op de terminals. Presynaptische membraan capaciteit metingen van exocytose toelaten dat een op de korte termijn plasticiteit van excitatoire neurotransmitters 14,15 bestuderen. Daarnaast kunnen op korte termijn en lange termijn plasticiteit van remmende neurotransmitter vrijlating uit amacrine cellen ook worden onderzocht door opnames van wederzijdse feedback inhibitie aankomst op de terminal Mb 21. Over korte tijd (bv. 10 ~ s), GABAergische wederzijdse feedback inhibitie van amacrine cellen ondergaat gepaarde puls depressie via GABA blaasje zwembad uitputting 11. De synaptische dynamiek van retinale microcircuits in de binnenste laag van plexiform het netvlies kan dus direct worden bestudeerd.
De hersenen-slice techniek was meer dan 40 jaar geleden geïntroduceerd, maar is nog altijd zeer bruikbaar voor het onderzoek van de elektrische eigenschappen van neuronen, zowel op de enkele cel soma, een dendriet of axon, en microcircuit synaptische level 19. Weefsels die zijn te klein om direct te verlijmen op de kamer snijden vaak de eerste ingebed in agar (of geplaatst op een filtreerpapier) en vervolgens in plakjes gesneden 20, 23, 18, 9. In deze video, we gebruik van de pre-embedding agar techniek met behulp van goudvissen netvlies. Een deel van de reus bipolaire cel terminals in onze plakjes van goudvissen retina zijn axotomized (axon-cut) tijdens het snijden procedure. Dit laat ons toe om enkele presynaptische zenuwuiteinde ingangen te isoleren, omdat het opnemen van axotomized terminals sluit de signalen van de soma-dendritische compartiment. Als alternatief kan men ook opnemen uit intacte Mb bipolaire cellen, door het opnemen van de terminals aan axonen die niet zijn gesneden tijdens het snijden procedure. In het algemeen zal het gebruik van dit experimenteel protocol hulp in studies van retinale synaptische fysiologie, microschakeling functionele analyse, en synaptische transmissie bij lint synapsen.
Een kritische en moeilijke stap in ons protocol is de overdracht van het stuk van het netvlies in de agar-oplossing (protocol 3.4). Het is noodzakelijk om voorzichtig te verwijderen het glasvocht en het resterende slice-oplossing uit de retina stuk en over te dragen zonder vervorming of buigen. Om dit te bereiken, gebruiken we een kleine spatel (21-401-25B, Fisherbrand) met een tip gebogen tot een hoek van 90 ° vormen, samen met schuine punt tang (11251-35, Fine Science Tools), om de retinale positie s…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken dr. Fred Rieke voor zijn vriendelijke uitleg van de agar-embedded netvlies slice voorbereiding toen we begonnen met het protocol in ons lab. We danken ook Lori Vaskalis voor de illustratie van schematisch overzicht en Drs. Veeramuthu Balakrishnan en Soyoun Cho voor nuttige commentaar op de tekst en video. Dit werk werd ondersteund door een NEI-NIH RO1 te verlenen, en was ook gedeeltelijk ondersteund door een Korea Research Foundation Grant gefinancierd door de Koreaanse regering [KRF-2008-357-E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |