Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.
Visuelle Reize werden erkannt und über einen weiten Dynamikbereich von Lichtintensitäten und Frequenzänderungen von spezialisierten Nervenzellen in der Retina vermittelt. Zwei Klassen von retinalen Nervenzellen Photorezeptoren und bipolaren Zellen, dies zu erreichen, indem Sie Lappenkäfig aktiven Zonen, die nachhaltig und mit hohem Durchsatz ermöglicht die Freisetzung von Neurotransmittern über lange Zeiträume. ON-Typ gemischt bipolare Zelle (Mb)-Terminals in der Goldfisch Netzhaut, die auf Lichtreize depolarisiert und erhalten gemischte Stäbchen und Zapfen Photorezeptor-Eingang, sind für das Studium der Band-Typ Synapsen sowohl aufgrund ihrer Größe (~ 10-12 geeignet Mikrometer Durchmesser) und ihre zahlreichen Quer-und wechselseitigen synaptischen Verbindungen mit amakrine Zelle Dendriten. Direkter Zugriff auf Mb Bipolarzelle Terminals in Goldfisch Netzhaut Scheiben mit der Patch-Clamp-Technik ermöglicht die Messung von präsynaptischen Ca 2 + Ströme, Membran-Kapazität ändert, und die gegenseitige synaptischen Feedback-Hemmung durch GABA vermittelte <sub> A und GABA C-Rezeptoren exprimiert auf den Terminals. Präsynaptischen Membran Kapazitätsmessungen der Exozytose erlauben es, die kurzfristige Plastizität der erregenden Neurotransmitter-Freisetzung 14,15 studieren. Darüber hinaus können kurzfristige und langfristige Plastizität inhibitorischer Neurotransmitter-Freisetzung aus Amakrinzellen auch durch Aufnahmen von gegenseitigen Feedback-Hemmung bei der Ankunft am Mb Klemme 21 untersucht werden. Über kurze Zeiträume (zB ~ 10 s), erfährt GABAergen gegenseitige Feedback-Hemmung von Amakrinzellen paired-Puls Depression über GABA Vesikel Pool Erschöpfung 11. Die synaptische Dynamik der retinalen Mikroschaltungen in der inneren plexiformen Schicht der Netzhaut kann somit direkt untersucht werden.
Das Gehirn-Slice-Technik wurde vor mehr als 40 Jahren führte jedoch immer noch sehr nützlich für die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen, sowohl auf die einzelne Zelle soma, single Dendrit oder Axon, und microcircuit synaptischen Ebene 19. Gewebe, die zu klein, um direkt auf die Schneiden Kammer verklebt werden sollen, werden oft erst in Agar eingebettet (oder platziert auf einem Filterpapier) und dann in Scheiben geschnitten 20, 23, 18, 9. In diesem Video, verwenden wir die Pre-embedding-Agar-Technik mit Goldfischen Netzhaut. Einige der riesigen bipolaren Zellen Terminals in unserer Scheiben Goldfisch Netzhaut axotomized (Axon-cut) beim Schneiden Verfahren. Dies ermöglicht uns, einzelne präsynaptischen Nervenendigung Eingänge zu isolieren, da die Aufnahme von axotomized Terminals schließt die Signale von der soma-dendritischen Kompartiment. Alternativ kann man auch aus intakten Mb Bipolarzellen aufzunehmen, durch die Aufnahme von Klemmen befestigt Axone, die nicht beim Schneiden Verfahren geschnitten wurden. Insgesamt wird diesen experimentellen Protokoll in Studien der retinalen synaptischen Physiologie, microcircuit funktionale Analyse und synaptische Übertragung an Synapsen Band zu unterstützen.
Ein kritischer und schwieriger Schritt in unserem Protokoll ist die Übertragung des Stückes von Netzhaut in den Agar-Lösung (Protokoll 3.4). Es ist notwendig, entfernen Sie vorsichtig den Glaskörper und Rest-slice-Lösung aus der Netzhaut Stück und übertragen sie ohne Verzerrung oder Biegen. Um dies zu erreichen, verwenden wir einen kleinen Spatel (21 bis 401-25B, Fisherbrand) mit einer Spitze gebogen, um einen 90 ° Winkel bilden, zusammen mit gebogener Spitze Pinzette (11251-35, Fine Science Too…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Fred Rieke für seine freundliche Erklärung des Agar-embedded Netzhaut Scheibe Vorbereitung, wenn wir mit dem Protokoll in unserem Labor begonnen. Wir danken auch Lori Vaskalis für die Darstellung der schematischen Überblick und Drs. Veeramuthu Balakrishnan und Soyoun Cho für die hilfreichen Kommentare zum Text und Video. Diese Arbeit wurde durch einen NEI-NIH RO1 gewähren unterstützt, und wurde teilweise auch durch einen Korea Research Foundation Grant von der koreanischen Regierung finanziert unterstützt [KRF-2008 bis 357-E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |