Una técnica en vivo imágenes de fluorescencia para cuantificar la reposición y la movilización de las vesículas sinápticas específicas (SV) se estanca en los terminales nerviosos centrales se describe. Dos rondas de SV de reciclaje son monitoreados en las terminales nerviosas que se proporciona un control interno.
Después de la liberación de neurotransmisores en las terminaciones nerviosas centrales, SV son rápidamente recuperados por endocitosis. Consultado el SV se volvió a llenar con los neurotransmisores y reincorporarse a la piscina de reciclaje, definida como la SVS que están disponibles para 1,2 exocitosis. La piscina de reciclaje en general, se puede subdividir en dos grupos distintos – la piscina fácilmente liberable (PVP) y el fondo de reserva (RP). Como sus nombres lo indican, el PVP se compone de SV que están disponibles de inmediato para la fusión, mientras que RP SV sólo se liberan durante 1,2 estimulación intensa. Es importante tener un método seguro de que los informes de la reposición diferencial de estas piscinas SV a fin de comprender 1) cómo SV tráfico después de los diferentes modos de endocitosis (como clatrina dependiente de la endocitosis y la actividad dependiente de la endocitosis a granel) y 2) los mecanismos de la el control de la movilización tanto de la PRR y RP en respuesta a diferentes estímulos.
Colorantes FM se emplean habitualmenteed para informar cuantitativamente el volumen de negocios SV en los terminales nerviosos centrales 3-8. Tienen una cola de hidrocarburo hidrofóbico que permite particionar reversible en la bicapa lipídica, y un grupo de cabeza hidrofílica que bloquea el paso a través de membranas. Los colorantes tienen poca fluorescencia en solución acuosa, pero su rendimiento cuántico se incrementa dramáticamente cuando particionado en la membrana de 9. Así, colorantes FM es ideal para el seguimiento de sondas fluorescentes que se reciclan activamente SV. El protocolo estándar para el uso de tinte de FM es la siguiente. En primer lugar se aplican a las neuronas y se toman durante la endocitosis (Figura 1). Después de no internalizadas tinte se lava fuera de la membrana plasmática, reciclado redistribuir SV dentro de la piscina de reciclaje. Estos SV son consumidos con estímulos descarga (Figura 1). Desde FM tinte de etiquetado de la SVS es cuántica 10, la caída de la fluorescencia resultante es proporcional a la cantidad de vesículas liberadas. De este modo, el reciclaje y la fusión de SV generados a partir de la previous ronda de la endocitosis puede cuantificarse.
Aquí, se presenta un protocolo que ha sido modificado para obtener dos elementos adicionales de información. En primer lugar, los estímulos descarga secuencial se utilizan para descargar diferencialmente el PVP y la RP, para permitir la cuantificación de la reposición de determinados grupos de SV. En segundo lugar, cada terminación nerviosa se somete el protocolo en dos ocasiones. Por lo tanto, la respuesta de la terminal nerviosa mismo en S1 se puede comparar con la presencia de una sustancia de ensayo en fase S2 (Figura 2), proporcionando un control interno. Esto es importante, ya que el grado de reciclaje de SV a través de las terminales nerviosas distintas es muy variable 11.
Cualquier seguidor cultivos neuronales primarios pueden ser utilizados para este protocolo, sin embargo, la densidad de la galvanización, soluciones y condiciones de estimulación están optimizados para las neuronas granulares del cerebelo (CGNs) 12,13.
Colorantes FM se utilizan ampliamente para investigar la función del nervio terminal en muchas preparaciones neuronales. Ellos se han empleado principalmente para controlar la extensión de cualquiera de endocitosis SV, la rotación de SV o la cinética de la exocitosis 6. El protocolo descrito extiende estos estudios para examinar la diferencia de la descarga de determinados grupos de SV. Esto proporciona información adicional con respecto a la reposición de las piscinas SV y también su grado de movilización.
Colorantes FM puede ser utilizada para etiquetar múltiples rondas de reciclaje de SV en los terminales nerviosos. Hemos explotado esta propiedad y diseñado protocolos en los que puede ser el volumen de negocios SV en cada terminal de control dos veces en los terminales nerviosos. Esto proporciona un control preciso de internos, lo cual es esencial debido a la naturaleza heterogénea de reciclaje de SV en los terminales nerviosos paralelo 11. A través de la utilización de la fase S1 como control interno, la recarga de los PVP, RP y el totalPiscina SV en la presencia de drogas puede ser confiable y comparar directamente.
Además de proporcionar información sobre el tamaño absoluto del reciclaje, piscinas y RP PVP bajo condiciones de estimulación diferentes, este protocolo también puede proporcionar datos para los siguientes – 1) La división de SV entre el PVP y RP en función de la piscina de reciclaje de S1 y S2, 2) el tamaño relativo de las piscinas S2 (RRP y RP) en función de la reserva total de reciclaje de S1 y 3) el tamaño relativo de cualquier grupo de SV se define en el S2 en función de la misma piscina en S1. Este protocolo en particular no proporcionará información sobre la cinética de descarga sin embargo, desde el tiempo de adquisición es demasiado lento (para mediciones cinéticas tiempos de adquisición deberá ser tan rápida como sea posible y descarga sincronizan automáticamente para capturar la imagen).
Nuestros 30 Hz 2 estímulos s evoca una medida idéntica de PVP descarga de sacarosa hipertónica 8. Dado que el tamaño de la venta al públicose define por la sacarosa hipertónica descarga 15, se puede afirmar que este protocolo de descarga todos los SV PVP, de acuerdo con estudios en las neuronas del hipocampo 16. La reserva está casi completamente agotados por tres trenes de 400 estímulos (40 Hz 10 s cada uno), ya que este estímulo se descarga una cantidad idéntica de medio de contraste para un nuevo paradigma (2 estímulos con KCl 50) que reduce el 95% de todos los SV marcado tinte 8,17. Cuantificación exacta de la magnitud tanto de la PRR y el fondo de reserva también depende de la adquisición de la información dentro del rango lineal dinámico de la cámara CCD.
Este protocolo simple también se puede modificar aún más. La fuerza de los estímulos de carga también se puede variar para determinar cómo la actividad neuronal y diferentes modos de endocitosis afectan reposición de SV de la piscina. Además, más de dos ciclos de carga y descarga también se puede realizar si es necesario. Este protocolo también se puede utilizar en las células transfectadas con sobreexpresión oARNhc vectores. Debido a la baja eficiencia de transfección de cultivos primarios de neuronas, proteínas que se expresan deben ser etiquetados con proteínas fluorescentes. Es esencial que estas etiquetas fluorescentes no interfieran con la señal de FM tinte (cian o utilizar proteínas de color rojo, por ejemplo). En este caso, las terminaciones nerviosas de las células transfectadas y no transfectadas, en el mismo campo de visión también puede ser comparado como un control adicional 8. En los experimentos de una comparación de la magnitud de la carga entre las cargas S1 y S2 es de poco valor, ya que la perturbación está presente durante las dos cargas. Partición de tinte entre piscinas SV todavía se pueden visualizar sin embargo 8.
Periodistas genética llamada pHluorins también se puede emplear para controlar la exocitosis y la endocitosis SV en cultivos neuronales primarios. Estas sondas utilizan un pH sensible a la proteína fluorescente verde en el medio ambiente pH luminal de los dominios de las proteínas marcadas SV como VAMP, sinaptofisina y VGLUT1 18 </sup>. Cuando se utiliza junto con inhibidores de la ATPasa vesicular, pHluorins puede reportar tanto la cinética y la magnitud de la movilización de la piscina SV 19. El enfoque basado en FM-dye descrito aquí tiene algunas ventajas sobre la técnica pHluorin, En primer lugar, colorantes FM proporcionar información sobre el modo SV endocitosis repone el RRP y las piscinas de reserva 8. Piscinas SV segundo lugar específicos pueden ser etiquetados con tintes de FM que tienen diferentes propiedades espectrales 20 y, finalmente, no hay ningún requisito para la transfección. Colorantes FM no puede proporcionar información sobre el tráfico entre el SV y el reciclaje de descanso piscinas SV sin embargo (en contraste con pHluorins 19), ya que por definición SV tiene que ser cargado con medio de contraste durante la endocitosis para ser visibles. Así, tanto los tintes FM y pHluorins tienen fortalezas y debilidades, y son más potentes cuando se utilizan en experimentos independientes para hacer frente a la misma pregunta.
Imágenes de alta calidad son esenciales para el análisis de validez y reproducibLe resultados. Mientras que la deriva horizontal puede ser fácilmente corregido, los experimentos en los que hay un desvío en el eje Z no se pueden recuperar. Por esta razón, es importante re-enfocar las imágenes antes de comenzar la descarga S1 y S2. En los casos en un deterioro significativo se ha producido fluorescentes, las correcciones de la caries se puede aplicar (por lo general, restando una huella previamente grabado de FM-cargado las células en ausencia de estimulación). Sin embargo, se sugiere que la corrección de la decadencia sólo se realiza para la representación gráfica y no a ser utilizado para cualquier análisis cuantitativo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)