中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員(SV)のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。 SVリサイクルの2つのラウンドは、内部統制を提供する同じ神経終末に監視されます。
中枢神経終末における神経伝達物質の放出の後、SVSは迅速にエンドサイトーシスによって取得されます。 SVSは、その後、神経伝達物質を充填し、エキソサイトーシスの1,2で使用可能なSVSなど定義されているリサイクルのプールを、再度参加している取得。容易に放出できるプール(RRP)と予備プール(RP) – リサイクルプールは一般的に2つの別個のプールに分割できます。その名前が示すように、RRPはRP SVSを強烈な刺激の1,2の間にのみリリースされている間の融合のために即座に使用できるようSVSの構成されています。 1)を理解するためにこれらのSVのプールの差動補充を報告する信頼性の高いアッセイを持つことが重要ですどのようにSVSのエンドサイトーシスの異なるモード後のトラフィック(たとえば、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよび活動依存バルクエンドサイトーシスなど)と2)のメカニズム別の刺激に応答してRRPとRPの両方の動員を制御する。
FM色素は、日常的に採用されていますedは定量的に中枢神経端末3-8のSV売上高を報告する。彼らは、膜を横切って脂質二重層で可逆パーティショニングを可能にする疎水性の炭化水素の尾部、および親水性のヘッドグループをブロックの通路を持っている。色素は水溶液中ではほとんど蛍光持っているが、膜9でパーティション化されたときに、その量子収率が飛躍的に増加する。したがって、FM色素は積極的にSVSをリサイクル追跡するための理想的な蛍光プローブである。 FM染料の使用のための標準プロトコルは、次のとおりです。まず、彼らは、神経細胞に適用され、エンドサイトーシス(図1)中に取り上げられている。非内部化染料の後、原形質膜、リサイクルのプール内でリサイクルされたSVSの再配布から洗い流される。これらのSVSはその後、アンロードの刺激(図1)を使用して消耗している。のSV FM色素のラベリングは、量子10であるので、結果として得られる蛍光の低下が放出小胞の量に比例します。このように、SVSのリサイクルと融合はPRから生成エンドサイトーシスのeviousラウンドは確実に定量することができる。
ここで、我々は、情報の2つの追加要素を取得するために変更されているプロトコルを示す。まず、シーケンシャルアンロードの刺激は、特定のSVのプールの補充の定量化を可能にするために、差RRPとRPをアンロードするために使用されます。第二に、それぞれの神経終末は二回プロトコルを受ける。従って、S1の同じ神経終末の応答は、内部統制を提供し、S2の位相(図2)における被験物質の存在と比較することができます。異なる神経端子間SVリサイクルの程度は11非常に可変であるため、これは重要です。
どんな接着初代神経培養はこのプロトコルのために使用されるかもしれない、しかし播種密度、ソリューションと刺激条件は、小脳顆粒ニューロン(CGNS)12,13用に最適化されています。
FM染料は広範囲に多くの神経細胞調製物中の神経ターミナルの機能を調査するために使用されます。これらはどちらSVのエンドサイトーシス、SV売上高またはエキソサイトーシス6の動力学の程度を監視するために主に用いられてきた。記述されたプロトコルは、特定のSVのプールのアンロードの差を調べるためにこれらの研究を拡張しています。これは、SVのプールの補充とも動員の彼らの程度に関する追加情報を提供します。
FM染料は同じ神経終末内でSVリサイクルの複数のラウンドにラベルを付けるために使用することができます。我々は、このプロパティを利用し、各端末におけるSV売上高が同じ神経末端に二回監視することができるプロトコルを設計した。これが原因で、並列神経の端子11にSVリサイクルの均質性に不可欠である正確な内部統制を、提供します。内部統制としてS1相の使用を介して、RRP、RPと合計の補充薬剤の存在下でSVのプールは確実にし、直接比較することができます。
リサイクルの絶対的な大きさの情報を提供するだけでなく、RRPとRPプールが異なる刺激条件下では、このプロトコルはまた、以下のデータを提供することができます – 1)リサイクルのプールの関数としてRRPとRP間のSVパーティショニングS1とS2、2用)の合計S1リサイクルのプールとS1の同じプールの関数としてS2内の任意の定義されているSVのプールの3)相対的な大きさの関数としてS2プールの相対的な大きさ(RRPおよびRP)。収集時間が遅すぎるので、この特定のプロトコルは、(速度測定のために収集時間が可能と画像の取り込みに同期を自動的にアンロードと同じくらい急速なはず)、しかし動態をアンロードに関する情報を提供することはありません。
私たちの30 Hzの2秒の刺激は、高張ショ糖8にアンロードRRPの同一の範囲を呼び起こす。 RRPのサイズ導入15アンロード高張ショ糖によって定義され、我々は、海馬ニューロン16の研究と一致し、このプロトコルは、すべてのRRP SVSをアンロードすることを明記することができます。この刺激は、すべての色素標識のSV 95%を枯渇させるパラダイム(50mMのKClを2刺激)に染料の同一量をアンロードするので、予備のプールはほぼ完全に400の刺激(40 Hzの10秒ごと)の三列車が消耗している8,17。 RRPと予備プールの両方のサイズの正確な定量化はまた、CCDカメラのダイナミックレンジ内での情報の取得に依存しています。
この単純なプロトコルは、さらに変更することができます。ローディング刺激の強さはまた別のエンドサイトーシスのモードがSVプールの補充をどのように影響するかを神経活動と決定するために変えることができます。必要に応じてさらに、ロードおよびアンロードの3つ以上のサイクルをも行うことができます。このプロトコルは、過剰発現またはどちらかをトランスフェクションした細胞でも使用できます。shRNAベクター。プライマリーニューロン培養の低いトランスフェクション効率のために、発現されたタンパク質は蛍光タンパク質でタグ付けする必要があります。それは、これらの蛍光タグは、FM色素の信号(例えば、シアンまたは赤色のタンパク質を使用)に干渉しないことが不可欠です。このインスタンスでは、ビューの同じフィールドにトランスフェクトおよび非トランスフェクト細胞からの神経終末はまた付加的な制御8として比較することができます。摂動は、両方の負荷の間に存在しているので、そのような実験ではS1とS2の負荷との間でのロードの程度の比較は、ほとんど価値がありません。 SVプールの間に染料のパーティショニングはまだしかし、8視覚化することができます。
遺伝記者はpHluorinsも初代神経培養におけるSVエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを監視するために用いることができると呼ばれる。このようなプローブは、VAMP、シナプトフィジンとVGLUT1 18などのタグ付きSV蛋白質の内腔ドメインのpH環境にpH感受性緑色蛍光タンパク質を使用してください</suP>。水疱性ATPアーゼ阻害剤と組み合わせて使用すると、pHluorinsはSVプール動員19の速度と程度の両方を報告することができます。ここで説明するFM -染料ベースのアプローチがpHluorinの技法に比べていくつかの利点を持って、まず、FM色素は、SVのエンドサイトーシスのモードは、RRPと予備プール8を補充する情報を提供しています。第二に、特定のSVのプールは、20種類のスペクトル特性を持ち、最終的にトランスフェクションの要件がないFM色素で標識することができます。定義SVはで表示されるようにエンドサイトーシス中に色素をロードしなければならないので、FM色素は、(pHluorins 19〜対照的に)しかし、休んでとリサイクルSVプールの間にSVトラフィックに関する情報を提供することはできません。したがって、FM色素とpHluorins両方の長所と短所を持っていると同じ問題に対処するための独立した実験で利用されるときに最も強力です。
高品質の画像は、有効な分析とreproducibのために不可欠です。ルの結果。水平方向のドリフトが簡単に補正することができる一方で、Z軸のドリフトがある実験を回復することはできません。このような理由で、S1とS2のアンロードを開始する前に画像を再集中することが重要です。かなりの蛍光減衰が発生した場合には、減衰補正が(通常は刺激の非存在下でFM -ロードされた細胞から、以前に記録されたトレースを減算すること)が適用されることがあります。しかし、減衰補正のみグラフィカルな表現のために実行され、任意の定量分析に使用されないことが示唆された。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ウェルカムトラスト(:084277参考)からの助成金によって支えられて。
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)