A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.
Após a liberação do neurotransmissor nos terminais nervosos central, são rapidamente recuperados SVs por endocitose. SVs recuperados são então recarregados com neurotransmissor e voltar a piscina de reciclagem, definido como SVs que estão disponíveis para 1,2 exocitose. A piscina de reciclagem geralmente podem ser subdivididos em dois grupos distintos – a piscina prontamente liberável (RRP) e da piscina de reserva (RP). Como seus nomes sugerem, o RRP consiste em SVs que estão imediatamente disponíveis para a fusão, enquanto RP SVs são liberados apenas durante 1,2 estimulação intensa. É importante ter um teste confiável que relata a reposição diferencial dessas piscinas SV, a fim de compreender 1) como SVs tráfego após diferentes modos de endocitose (como clatrina-dependente e endocitose dependente de atividade endocitose granel) e 2) os mecanismos de controlar a mobilização de ambos os RRP e RP em resposta a estímulos diferentes.
Corantes FM são rotineiramente empregamed quantitativamente relatório volume de negócios SV em terminais de nervo central 3-8. Eles têm uma cauda de hidrocarbonetos hidrofóbicas que permite particionamento reversível na bicamada lipídica, e um grupo cabeça hidrofílico que bloqueia a passagem através das membranas. Os corantes têm pouco de fluorescência em solução aquosa, mas o seu rendimento quântico aumenta dramaticamente quando particionado na membrana 9. Assim corantes FM são ideais sondas fluorescentes para acompanhar ativamente a reciclagem SVs. O protocolo padrão para uso de corante FM é a seguinte. Primeiro, eles são aplicados aos neurônios e são captados durante a endocitose (Figura 1). Depois de não-internalizado corante é lavado da membrana plasmática, redistribuir SVs reciclados dentro do pool de reciclagem. Estes são, então, esgotadas SVs usando estímulos descarga (Figura 1). Desde FM rotulagem tintura de SVs é quantal 10, a queda de fluorescência resultante é proporcional à quantidade de vesículas libertadas. Assim, a reciclagem e fusão de SVs gerada a partir da previous rodada de endocitose podem ser confiavelmente quantificados.
Aqui, apresentamos um protocolo que foi modificado para obter dois elementos adicionais de informação. Em primeiro lugar, os estímulos seqüenciais são usados para descarga diferencialmente descarregar o RRP eo RP, para permitir a quantificação da reposição de piscinas específicas SV. Em segundo lugar, cada terminal nervoso sofre o protocolo duas vezes. Assim, a resposta do terminal nervoso mesmo em S1 pode ser comparada com a presença de uma substância de ensaio na fase S2 (Figura 2), proporcionando um controle interno. Isso é importante, dado que a extensão de SV reciclagem nos terminais nervosos diferentes é altamente variável 11.
Qualquer adepto culturas primárias neuronais podem ser usados para este protocolo, porém a densidade de plaqueamento, soluções e condições de estimulação são otimizados para neurônios granulares do cerebelo (CGNs) 12,13.
FM corantes são usados extensivamente para investigar a função do nervo terminal em muitas preparações neuronal. Eles têm sido utilizados principalmente para acompanhar o grau de qualquer endocitose SV, SV volume de negócios ou a cinética da exocitose 6. O protocolo descrito estende esses estudos para examinar o diferencial de descarga de piscinas específicas SV. Esta fornece informações adicionais sobre a reposição de piscinas SV e também a sua extensão de mobilização.
Corantes FM pode ser usado para rotular várias rodadas de reciclagem de SV dentro dos terminais nervosos mesmo. Temos explorado esta propriedade e projetado protocolos em que SV volume de negócios em cada terminal pode ser monitorado duas vezes na mesma terminais nervosos. Isso proporciona um controle preciso interna, que é essencial devido à natureza heterogénea de reciclagem SV em terminais nervosos paralelo 11. Através do uso da fase de S1 como um controle interno, a recarga do PRR, RP eo totalSV piscina na presença de drogas pode ser confiável e directamente comparados.
Além de fornecer informações do tamanho absoluto da reciclagem, piscinas RRP e RP em condições de estimulação diferente, este protocolo também pode fornecer dados para o seguinte – 1) O particionamento de SVs entre o PRR e RP em função da piscina de reciclagem para S1 e S2, 2) o tamanho relativo das piscinas S2 (RRP e RP) em função da piscina reciclagem total S1 e 3) o tamanho relativo de qualquer piscina SV definido no S2 em função da mesma piscina em S1. Este protocolo particular, não fornecerá informações sobre cinética de descarga no entanto, desde o tempo de aquisição é muito lento (para medições cinética tempos de aquisição deve ser o mais rápido possível e descarga automaticamente sincronizados para capturar imagem).
Os nossos 30 Hz estímulos 2 s evoca uma extensão idêntica de RRP descarga à sacarose hipertônica 8. Como o tamanho do PRRé definida por sacarose hipertônica descarga 15, podemos afirmar que este protocolo descarrega todos os SVs RRP, de acordo com estudos em neurônios do hipocampo 16. O pool de reserva é quase completamente esgotada por três trens de 400 estímulos (40 Hz 10 s cada) já que este estímulo descarrega uma quantidade idêntica de tintura para um paradigma (2 estímulos com 50 mM KCl), que esgota os 95% de todos os SVs dye-rotulados 8,17. Quantificação exata do tamanho de ambos os RRP e piscina reserva é também dependente de aquisição de informação dentro da faixa linear dinâmica da câmera CCD.
Este protocolo simples também pode ser modificado ainda. A força de estímulos de carga também pode ser variado para determinar como a atividade neuronal e modos diferentes afetam endocitose SV reabastecimento da piscina. Além disso, maior do que dois ciclos de carga e descarga também pode ser realizada, se necessário. Este protocolo também pode ser usado em células transfectadas tanto com superexpressão ouvetores shRNA. Devido à eficiência de transfecção baixos de culturas primárias de neurônios, proteínas expressas devem ser marcadas com proteínas fluorescentes. É essencial que essas marcas fluorescentes não interferir com o sinal FM corante (use ciano ou proteínas vermelho, por exemplo). Neste exemplo, terminais nervosos das células transfectadas e não transfectadas no mesmo campo de visão também pode ser comparada como um controle adicional de 8. Em tais experimentos uma comparação da extensão de carga, entre cargas de S1 e S2 é de pouco valor, uma vez que a perturbação está presente durante as duas cargas. Particionamento de corante entre piscinas SV ainda pode ser visualizado no entanto 8.
Repórteres genética chamada pHluorins também pode ser empregado para monitorar SV exocitose e endocitose na cultura neuronal primária. Estas sondas usar um pH-sensível proteína verde fluorescente ao ambiente pH de domínios luminal de proteínas tag SV, como VAMP, sinaptofisina e VGLUT1 18 </sup>. Quando usado em conjunto com inibidores da ATPase vesicular, pHluorins pode relatar tanto a cinética ea extensão da SV mobilização piscina 19. A abordagem FM-dye com base descrita aqui tem algumas vantagens sobre a técnica pHluorin, Em primeiro lugar, corantes FM fornecer informações sobre quais SV modo endocitose reabastece o RRP e piscinas reserva 8. Em segundo lugar piscinas específicas SV pode ser rotulado com corantes FM que possuem diferentes propriedades espectrais 20 e, finalmente, não há nenhuma exigência para a transfecção. Corantes FM não pode fornecer informações sobre o tráfego entre o SV de descanso e reciclagem piscinas SV porém (em contraste com pHluorins 19), uma vez que, por definição, SVs têm de ser carregados com tinta durante a endocitose a ser visível. Assim, tanto corantes FM e pHluorins têm pontos fortes e fracos e são mais poderosos quando utilizados em experimentos independentes para lidar com a mesma pergunta.
Imagens de alta qualidade são essenciais para a análise válida e reproducible resultados. Enquanto o deslizamento horizontal pode ser facilmente corrigido, experimentos onde há um desvio no eixo Z não podem ser recuperados. Por esta razão, é importante re-focar imagens antes de iniciar a descarrega S1 e S2. Nos casos em que uma deterioração significativa fluorescentes ocorreu, correções decadência pode ser aplicado (geralmente subtraindo um traço previamente gravados a partir de células FM-carregados na ausência de estimulação). No entanto, sugere-se que a correção de atenuação é realizada somente para a representação gráfica e não deve ser usado para qualquer análise quantitativa.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)