Este artigo descreve um método para obter uma estrutura tridimensional (3D) das moléculas helicoidalmente montados usando crio-microscopia eletrônica. Neste protocolo, usamos assembléias HIV-1 capsídeo para ilustrar o processo de reconstrução 3D detalhados para alcançar um mapa de densidade pelo método de reconstrução iterativa helicoidais real-espaço.
Cryo-microscopia eletrônica (Cryo-EM), combinado com processamento de imagem, é uma ferramenta cada vez mais poderosos para a determinação da estrutura de complexos macromoleculares de proteínas e montagens. Na verdade, microscopia eletrônica única partícula 1 e bidimensional (2D) de elétrons cristalografia de dois tornaram-se relativamente metodologias de rotina e um grande número de estruturas foram resolvidos com estes métodos. Ao mesmo tempo, processamento de imagem e reconstrução tridimensional (3D) de objetos helicoidal tem se desenvolvido rapidamente, especialmente, a iterativa helicoidal espaço real de reconstrução do método (IHRSR) 3, que utiliza ferramentas de análise única partícula em conjunto com simetria helicoidal. Muitas entidades biológicas função em formas filamentosas ou helicoidais, incluindo filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, fibras amilóides 6, vírus do mosaico do tabaco 7, 8 e flagelos de bactérias, e, por um mapa de densidade 3D de uma entidade helicoidal pode ser alcançado a partir de uma única projeção imagem, em comparação com as imagens muitas necessários para a reconstrução 3D de um objeto não-helicoidal, com o método IHRSR, análise estrutural de tais flexível e desordenada assembléias helicoidais agora é atingível.
Neste artigo de vídeo, nós fornecemos protocolos detalhados para a obtenção de um mapa 3D da densidade de um conjunto de proteínas helicoidal (HIV-1 capsídeo 9 é nosso exemplo), incluindo protocolos para crio-EM preparação de amostras, uma dose baixa de coleta de dados por Cryo-EM, a indexação de padrões de difração helicoidal, e processamento de imagem e reconstrução 3D usando IHRSR. Em comparação com outras técnicas, crio-preservação EM oferece espécime ideal sob condições quase nativo. Amostras são incorporados em uma fina camada de gelo vítreo, por congelação rápida, e com imagens em microscópios de elétrons à temperatura de nitrogênio líquido, sob condições de baixas doses para minimizar os danos da radiação. Imagens da amostra são obtidas sob condições quase nativo à custa de sinal baixo e de baixo contraste nas micrografias registradas. Felizmente, o processo de reconstrução helicoidal tem sido amplamente automatizado, com exceção de indexar o padrão de difração helicoidal. Aqui, descrevemos uma abordagem para indexar estrutura helicoidal e determinar simetrias helicoidal (parâmetros helicoidais) de micrografias digitalizadas, um passo essencial para a reconstrução 3D helicoidal. Brevemente, obtemos um mapa de densidade inicial de 3D, aplicando o método IHRSR. Este mapa inicial é, então, iterativamente refinados através da introdução de restrições para os parâmetros de alinhamento de cada segmento, assim, controlar os seus graus de liberdade. Aperfeiçoamento é alcançado através da correcção para a função de transferência de contraste (CTF) do microscópio eletrônico (correção de amplitude e fase) e, otimizando a simetria helicoidal da assembléia.
Apresentamos um conjunto de protocolos para fornecer uma abordagem simples para obtenção de estruturas 3D de objetos helicoidal. Utilizando os procedimentos descritos, nós adquirimos uma estrutura 3D do HIV-1 montagem do capsídeo de um único tubo de imagem (176 segmentos). Estruturas de alta resolução pode ser alcançado através da inclusão de mais dados de imagem.
Existem vários pontos críticos para a coleta de dados e análise ideal: primeiro, durante a preparação de uma amostra de crio-EM, a solução da amostra devem ser apagados, deixando uma camada fina e uniforme de solução que é ligeiramente mais espessa do que o tamanho da amostra. Existem várias maneiras diferentes para apagar a amostra. Para bactérias e células de amostras tubular, tais como HIV-1 CA montagem, mata-borrão de um lado, particularmente na parte de trás lado, é mais adequado.
Segundo, a lateralidade da hélice precisa ser determinado, como esta não pode ser feito por indexação helicoidal ou reconstrução. Uma prática comum é usar freeze-ataque, seguido pelo rotary shadowing 18 para determinar a lateralidade. Destreza manual também pode ser determinado pós-reconstrução quando a resolução do mapa de densidade é suficientemente elevada; os modelos 3D atômico de componentes individuais devem se encaixar bem no mapa de densidade quando um handedness correta é assumida. Caso contrário, a lateralidade oposto deve ser assumida.
Terceiro, um filtro de Wiener deve ser usado durante o processamento de imagem, tanto para fase e correção de amplitude, para reduzir a amplificação de ruído. Desde o CTF de uma única imagem sempre tem cruzamentos de zero, parte da informação no espaço recíproco é perdido. Portanto, é necessário dispor de dados de projeção vários conjuntos incluídos para reconstrução 3D, cada um com imagens em valores defocus diferente.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Gongpu Zhao e Danxia Ke para suporte técnico. Agradecemos a drs. Edward Egelman e Niko Grigorieff para compartilhamento de seus softwares de processamento de imagem. Reconhecemos também o pessoal de apoio da Biologia Estrutural Cryo-EM facilidade e Beowulf cluster e grade da Universidade de Pittsburgh School of Medicine. Este trabalho foi financiado pela GM082251 e GM085043.
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |