Cet article décrit une méthode pour obtenir un en trois dimensions (3D) la structure des molécules hélice assemblés par cryo-microscopie électronique. Dans ce protocole, nous utilisons assemblées VIH-1 capside pour illustrer la procédure de reconstruction 3D détaillée pour réaliser une carte de densité par la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel.
Cryo-microscopie électronique (cryo-EM), combiné avec le traitement d'image, est un outil puissant pour la détermination de la structure des complexes de protéines et des assemblages macromoléculaires. En fait, seule la microscopie électronique de particules 1 et à deux dimensions (2D) cristallographie électronique 2 sont devenus des méthodologies relativement courantes et un grand nombre de structures ont été résolus en utilisant ces méthodes. Dans le même temps, le traitement d'image et en trois dimensions (3D) la reconstruction d'objets hélicoïdale s'est rapidement développée, en particulier, l'itératif hélicoïdale espace réel de reconstruction (IHRSR) la méthode 3, qui utilise des outils simples d'analyse des particules en conjonction avec une symétrie hélicoïdale. De nombreuses entités biologiques fonction dans les formes filamenteuses ou hélicoïdale, dont les filaments d'actine 4, 5 microtubules, fibres amyloïdes 6, 7 virus mosaïque du tabac, et les flagelles des bactéries 8, et, parce que une carte de densité d'une entité 3D hélicoïdale peut être atteint par une seule projection l'image, par rapport aux images de nombreux nécessaires pour la reconstruction 3D d'un objet non hélicoïdales, avec la méthode IHRSR, analyse structurale de ces assemblages flexibles et désordonnés hélicoïdale est maintenant réalisable.
Dans cet article, vidéo, nous fournissons des protocoles détaillés pour l'obtention d'une carte de densité 3D d'un assemblage de protéines hélicoïdales (VIH-1 capside 9 est notre exemple), y compris des protocoles pour la préparation des échantillons cryo-EM, faible dose de collecte de données par cryo-EM, l'indexation des figures de diffraction hélicoïdale et le traitement d'image et de la reconstruction 3D utilisant IHRSR. Comparé à d'autres techniques, la cryo-EM offre conservation des spécimens optimale dans des conditions proches des conditions natives. Les échantillons sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse, par congélation rapide, et imagée dans les microscopes électroniques à la température de l'azote liquide, dans des conditions à faible dose pour minimiser les dégâts d'irradiation. Exemples d'images sont obtenues dans des conditions quasi native aux dépens des signaux faibles et faible contraste dans les micrographies enregistrées. Heureusement, le processus de reconstruction hélicoïdale a été largement automatisée, à l'exception de l'indexation du spectre de diffraction hélicoïdale. Ici, nous décrivons une approche à l'index structure hélicoïdale et de déterminer les symétries hélicoïdale (paramètres hélicoïdaux) de micrographies numérisés, une étape essentielle pour la 3D hélicoïdale de reconstruction. Brièvement, on obtient une carte de la densité initiale de 3D en appliquant la méthode IHRSR. Cette carte initiale est ensuite itérativement affiné par l'introduction de contraintes pour les paramètres d'alignement de chaque segment, de manière à contrôler leurs degrés de liberté. Une nouvelle amélioration est obtenue en corrigeant pour la fonction de transfert de contraste (FCE) du microscope électronique (correction d'amplitude et phase) et en optimisant la symétrie hélicoïdale de l'assemblée.
Nous présentons un ensemble de protocoles pour fournir une approche simple pour obtenir des structures 3D d'objets en hélice. En utilisant les procédures décrites, nous avons acquis une structure 3D du VIH-1 assemblage de la capside partir d'une image simple tube (176 segments). Structures à plus haute résolution peut être obtenue en incluant des données d'image de plus.
Il ya plusieurs points critiques pour la collecte des données optimale et d'analyse: d'abord, lors de la préparation d'un échantillon de cryo-EM, la solution de l'échantillon doit être effacé, laissant un uniforme, fine couche de solution qui est légèrement plus épais que la taille de l'échantillon. Il ya plusieurs façons différentes d'effacer l'échantillon. Pour les cellules bactériennes et de spécimens tubulaires, telles que le VIH-1 de l'Assemblée CA, effaçant d'un côté, en particulier de l'arrière-côte, est la plus appropriée.
Deuxièmement, l'impartialité de l'hélice doit être déterminée, car cela ne peut se faire par l'indexation hélicoïdale ou de reconstruction. Une pratique courante est d'utiliser le gel gravure, suivie par l'observation rotative 18 pour déterminer impartialité. Impartialité peut également être déterminée d'après-reconstruction quand la résolution de la carte de la densité est suffisamment élevée; les modèles 3D atomiques des composants individuels devraient s'intègrent bien dans la carte de la densité quand un autoritarisme est supposée correcte. Sinon, l'impartialité inverse devrait être assumée.
Troisièmement, un filtre de Wiener doit être utilisé pendant le traitement d'image, pour les deux phases et de correction d'amplitude, de réduire l'amplification du bruit. Depuis le FCT à partir d'une seule image a toujours des passages par zéro, une partie de l'information dans l'espace réciproque est perdu. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de données de projection de multiples jeux inclus pour la reconstruction 3D, chaque imagées à des valeurs différentes défocalisation.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zhao et Gongpu Danxia Ke pour le soutien technique. Nous remercions les Drs. Edward Egelman et Niko Grigorieff pour partager leur logiciel de traitement d'image. Nous reconnaissons également le personnel qui soutiennent la biologie structurale cryo-EM installations et cluster Beowulf et la grille à l'Université de Pittsburgh de la médecine. Ce travail a été soutenu par GM082251 et GM085043.
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |