本文介绍了一种方法来获得一个三维(3D)螺旋组装使用低温电子显微镜的分子结构。在这个协议中,我们使用的HIV – 1衣壳集会,说明详细的三维重建过程,实现了由迭代螺旋空间重构方法的密度图。
低温电子显微镜(冷冻电镜),与图像处理相结合是一个日益强大的工具结构的大分子蛋白复合物和集会的决心。事实上,单粒子电子显微镜1和二维(2D)电子晶体已成为相对常规的方法和大量的结构已经解决了使用这些方法。同时,图像处理和三维(3D)重建螺旋对象迅速的发展,特别是迭代螺旋真正空间重建(IHRSR) 方法 3,它采用单粒子分析工具,结合螺旋对称。许多生物实体的功能丝状或螺旋形式,包括微丝,微管 5,淀粉样纤维 6,烟草花叶病毒 7,细菌鞭毛 8,因为可以从一个单一的投影实现三维密度图的螺旋实体现在达到的形象,相比非螺旋对象的三维重建所需的许多图像,使用的IHRSR方法,结构分析等灵活和无序的螺旋集会。
在这个视频文章中,我们获得的螺旋蛋白大会的三维密度图(HIV – 1衣壳是我们的榜样),包括冷冻电镜冷冻电镜样品制备,低剂量的数据收集协议,索引提供了详细的协议螺旋衍射图案,图像处理和三维重建,使用IHRSR。与其他技术相比,冷冻电镜接近原生的条件下提供最佳的标本保存。样品嵌在一层薄薄的玻璃体冰,快速冷冻,在电子显微镜和影像在低剂量条件下,在液氮温度下,以尽量减少辐射的伤害。牺牲在低信号和低对比度的记录显微接近原生的条件下获得的样品图像。幸运的是,螺旋重建的过程中已经在很大程度上实现了自动化,索引螺旋衍射图样的异常。在这里,我们描述了一个方法,指数螺旋结构,并确定螺旋对称性,从数字化显微,三维螺旋重建的重要一步(螺旋参数)。简单地说,我们得到一个初始的3D密度地图应用IHRSR方法。这最初的地图,然后反复提炼为每个细分市场的定位参数推出的约束,从而控制他们的自由程度。进一步改善,取得了纠正的对比传递函数(CTF)的电子显微镜(振幅和相位校正),并通过优化大会的螺旋对称性。
我们目前的协议来提供一个简单的方法来获得螺旋物体的三维结构。使用所描述的程序,我们收购了从单管(176段)的HIV – 1衣壳大会的三维结构。包括更多的图像数据结构,可以实现更高的分辨率。
有最佳的数据收集和分析的几个关键点:第一,在一个冷冻电镜标本的制备,样品溶液应被涂抹了,留下一个统一的,略高于样本大小厚的一层薄薄的解决方案。有几种不同的方式印迹样品。对于细菌的细胞和管状的标本,如HIV – 1 CA大会,印迹,特别是从背面,从一个侧,是最合适的。
二,螺旋霸道的需要确定,因为这不能由螺旋索引或重建。一个常见的做法是用冷冻蚀刻,旋转阴影18,以确定霸道。偏手也可以被确定后重建时的密度图的分辨率足够高,各个组件的三维原子模型应符合密度图时假设是正确的霸道。否则,应假设相反的霸道。
第三,应该是一个维纳滤波器在图像处理,相位和幅度校正,以减少噪声放大。由于从一个单一的形象CTF,总是有过零丢失,在倒易空间的信息的一部分。因此,有必要拥有多个投影数据集为每个影像三维重建,包括在不同的散焦值。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢技术支持公仆赵博士和丹霞柯。我们感谢博士。爱德华Egelman和尼科Grigorieff分享他们的图像处理软件。我们也承认的工作人员,支持冷冻电镜设施,并在美国匹兹堡大学医学院的Beowulf集群和电网结构生物学。这项工作是支持由GM082251和GM085043。
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |