이 문서는 cryo – 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV – 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.
이미지 프로세싱과 결합 Cryo – 전자 현미경 (cryo – EM)는, macromolecular 단백질 단지와 어셈블리의 구조 결정에 대한 점점 더 강력한 도구입니다. 사실, 단일 입자 전자 현미경 1 (2D) 2 차원은 전자 crystallography 2 상대적으로 일상적인 방법론과 구조의 많은되고있는 이러한 방법을 사용하여 해결했습니다. 동시에, 이미지 처리 및 헬리컬 객체의 세 차원 (3D) 재건은 빠르게 특히 나선형 대칭과 함께 단일 입자 분석 도구를 사용하여 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 방법 3을 반복, 발전시켜 왔습니다. 나선형 엔티티의 3D 밀도지도가 하나의 투영에서 획득 할 수 있기 때문에 대부분의 생물 학적 실체가 filamentous 또는 헬리컬 굴지의 필라멘트 4, microtubules 5, 아밀로이드 섬유 6, 담배 모자이크 바이러스 7, 박테리아 flagella 8 포함한 양식, 그리고에 기능 IHRSR 방식이 아닌 나선형 오브젝트의 3D 재건에 필요한 다양한 이미지, 등 유연하고 무질서 나선형 어셈블리의 구조 분석에 비해 이미지는 지금 실현합니다.
이 비디오를 문서에서, 우리는 cryo – EM으로 cryo – EM 시료 준비, 저용량 데이터 수집을위한 프로토콜을 포함 헬리컬 단백질 어셈블리의 3D 밀도지도 (HIV – 1 capsid 9의 예입니다), 인덱싱를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 헬리컬 회절 패턴, 그리고 IHRSR를 사용하여 이미지 프로세싱 및 3D 재건. 다른 기술에 비해, cryo – EM은 근처 기본 조건 하에서 최적의 표본 보존을 제공합니다. 샘플은 빠른 냉동으로 유리 얼음의 얇은 레이어에 포함된, 그리고 방사선 피해를 최소화하기 위해 저용량 조건 하에서 액체 질소 온도에서 전자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 샘플 이미지는 낮은 신호 및 기록 micrographs 낮은 콘트라스트의 비용으로 근처 기본 조건 하에서 얻을 수 있습니다. 다행히, 나선형 재구성하는 과정은 크게 헬리컬 회절 패턴을 색인을 제외하고, 자동되었습니다. 여기, 우리는 인덱스 헬리컬 구조 방식을 설명하고 디지털 micrographs, 3D 나선형 재건을위한 필수적인 단계에서 나선형 symmetries을 (헬리컬 매개 변수)를 결정합니다. 간단히, 우리는 IHRSR 방법을 적용하여 초기 3D 밀도지도를 구하십시오. 이 초기지도는 다음 반복함으로써 자신의 자유도를 조절, 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 제약을 도입하여 세련됩니다. 더 개선은 전자 현미경 (진폭 및 위상 보정)의 대비 전송 기능 (CTF)을 수정하여하고 어셈블리의 나선형 대칭을 최적화하여 이루어진다.
우리는 나선형 오브젝트의 3D 구조를 얻기 위해 직접적인 접근을 제공하는 프로토콜의 집합을 제시한다. 설명한 절차를 사용하여, 우리는 하나의 튜브 이미지 (176 세그먼트)에서 HIV – 1 capsid 어셈블리의 3D 구조를 인수했다. 높은 해상도의 구조는 더 많은 이미지 데이터를 포함하여 얻을 수 있습니다.
최적의 데이터 수집 및 분석을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다 첫 번째는 cryo – EM 표본의 준비 기간 동안, 샘플 솔루션은 표본의 크기보다 약간 두껍 솔루션의 유니폼, 얇은 레이어를 떠나 멀리 blotted해야합니다. 예제를 얼룩하는 여러 가지 방법이 있습니다. 특히 백 측면에서, 한 측면에서 모래 바닥 세균 세포와 같은 HIV – 1 CA 어셈블리로 관형 표본, 들어 가장 적합합니다.
둘째, 나선형의 handedness이가 나선형 색인을 생성하거나 재구성하여 수행할 수 없으므로, 결정되어야합니다. 일반적인 연습은 로타리가 handedness을 결정하는 18 붙인 다음 냉동 에칭을 사용하는 것입니다. 밀도지도의 해상도가 충분히 높은 경우 Handedness 또한 이후 재건을 결정 수 있으며 정확한 handedness를 가정하면 개별 구성 요소의 3D 모델은 원자 밀도지도에 잘 맞지도한다. 그렇지 않으면, 반대 handedness을 가정해야합니다.
셋째, 위너 필터는 잡음 증폭을 줄이기 위해, 위상과 진폭 보정 모두, 이미지 처리하는 동안 사용해야합니다. 하나의 이미지에서 CTF는 항상 제로 횡단을 가지고 있기 때문에, 상호 공간에서 정보의 일부가 손실됩니다. 따라서 다른 defocus 값에서 3D 재구성, 각각의 몇 군데에 포함 여러 투영 데이터 집합이 필요합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 기술 지원을위한 박사 Gongpu 조 및 Danxia 애 감사드립니다. 우리는 DRS 감사합니다. 자신의 이미지 처리 소프트웨어를 공유하기위한 에드워드 Egelman와 니코 Grigorieff. 우리는 또한 구조 cryo – EM 시설 생물학과 의학의 피츠버그 학교의 대학에서 베오울프 클러스터와 그리드를 지원하는 직원을 인정합니다. 이 작품은 GM082251와 GM085043 지원했다.
Name | Source | Comments |
Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |