Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.
Microiontophoresis deneysel bir hazırlık içinde belirli bir yerinde bir çözünen teslim mikropipet ucu üzerinden akım geçişi gerektirir. Microiontophoresis tekrarlanabilir nöronlar 2 üzerine nörotransmitter ve nöropeptitlerin sunarak sinaptik iletim 1 taklit edebilirsiniz. İhmal edilebilir hacmi (sıvı) deplasman deneysel hazırlanması mekanik bozukluğu ortadan kaldırır. 3 mikrosirkülasyon bu tekniklerin uyarlanması vazodilatasyon ve vazokonstrüksiyon mekanizmaları in vivo 4,5 mikroskobik düzeyde incelenmesi gereken sağladı. Gibi lokalize teslim sistemik kan basıncı ve doku kan akımı ya da dönüşlü değişiklikler, böylece mikrodamarlar içsel özelliklerini ifşa çağrıştıran olmadan mikrovasküler bir ağ içinde tanımlanmış siteler okudu vazomotor yanıtları önemli bir avantaj sağlıyor.
Microiontophoresis bir sınırlaması ilgi site teslim ajan konsantrasyonu tam olarak tespit 6 zor olmasıdır. Bununla birlikte, mikropipet ucu serbest ejeksiyon akım şiddeti ve süresi 2,7 orantılıdır gibi tekrarlanabilir uyaran-tepki ilişkileri kolayca tanımlanan deneysel koşullar altında (aşağıda açıklanmıştır) tespit edilebilir. Microiontophoretic teslim etkileyen Ek faktörler çözünen konsantrasyon ve çözelti içinde iyonizasyon içerir. Mikropipet ucunun iç çapı istinat akımı ile dengelendi olabilir difüzyonal 'kaçak', en aza indirmek için ~ 1 mm veya daha az olmalıdır. Böylece dışa akım (pozitif) bir katyon ve mikropipet içinde tutmak için kullanılan bir negatif akım çıkarmak için kullanılır.
Mikropipetler Fabrikasyon sofistike elektronik Elcikler 8 ile kolaylaştırılır. Mikropipetler bir filament içeren cam kapiller tüplerin çekti mikropipet ucu içine 'fitilleri' çözüm arka uç ("yeniden toprakla") dolu. Bu ilgi ve çözüm çıkartma çözüm mikropipet lümenine içeren bir şırıngaya bağlı bir microcapillary tüp ekleyerek yapılır. Mikromanipülatörler deneysel bir hazırlık içinde mikropipetler istenen yerleştirme sağlar. Hareketli bir taban üzerine monte mikromanipülatörler mikrovasküler ağları (aşağıda geliştirilen) topografya göre hazırlık etrafında yerleştirilmiş olabilir.
– İşbu protokol microiontophoresis asetilkolin (ACh + Cl): fare Cremaster'ın kas hazırlık endotel bağımlı vazodilatasyon üretmek için bir arteriyol (Jüpiter ID # 2874 ilişkili protokol) üzerine göstermektedir. Stimulus teslimat elektronik bir tetikleyici ile dijital görüntü elde etme ile senkronize edilir. Cx40 BAC-GCaMP2 transgenik farelerin 9 kullanımı yaşayan mikrosirkülasyon arterioler endotel hücreleri vazodilatasyon altında yatan hücre içi kalsiyum yanıtları görselleştirme sağlar.
Burada açıklanan protokol microiontophoresis için mikropipetler hazırlanması ve uygulanması için yöntemler göstermektedir. Asetilkolin Teslimat anestezi fare arteriollerde kalsiyum sinyalizasyon altta yatan endotel bağımlı vazodilatasyon göstermek için kullanılır. Çalışmamızın sonuçları göstermektedir ki ACh microiontophoresis mikropipet (Şekil 3) güncel ejeksiyon yoğunluğu ile endotel hücre kalsiyum floresan artar artar üzerinde mesafe. Dinlenme koşullar altında floresan artış eksikliği mikropipet ACh önemsiz kaçak gösterir. 100 nA uyaran yoğunluğu (Şekil 3, efsane) yanıt eksikliği stimülasyon bir eşik yoğunluğunu artırmak için endotel hücre kalsiyum için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu teknikleri diğer vazoaktif ajanlar ve doku hazırlıkları kolayca adapte edilebilir.
Pratik Düşünceler: microiontophoresis arterioler reaktivite çalışma ile çalışan, bazı şeyleri kabul edilmelidir. Teslim agonist gerçek konsantrasyonunu belirlemek zor olsa da, uyaran-yanıt eğrileri hazırlıkları içinde ve arasında tekrarlanabilir. Bu darbe süresi sabit tutarak (örneğin, 500 ms) ve ejeksiyon akımı (Şekil 3 örneğin, 250, 500 ve 1000 nA) değişen yapılabilir. Alternatif olarak, mevcut ejeksiyon sabit tutulur olabilir (örneğin, 500 nA) ve darbe süresi değişken (örneğin, 250, 500 ve 1000 ms). Tanımlanmış bir agonist konsantrasyonu eylemleri için bir başvuru için, hazırlama, uygun bir çözüm 5 ile superfused olabilir . Çözünen ejeksiyon için itici güç elektrik yükü hareketi olduğundan, teslim edilecek ajan mikropipet yerinden net ücret taşımalıdır. Ilgi ajan birincil sorumlu taşıyıcısı olduğundan emin olmak için, elektro-osmoz en aza indirmek için yüksek konsantrasyon (örneğin, ACh için 1 M) çözülür. Mikropipet dolum çözüm pH manipüle gerektirdiğinde, araç kontrolleri, herhangi bir non-spesifik etkilerini tespit etmek için gereklidir. Uygun kontrolleri de yalnız akım geçişi için yapılmalıdır (örneğin, izotonik tuzlu su ile dolu mikropipetler kullanarak). Sürümü kendi sitesinden ajan yayılması için etkili mesafe tespit olmalı ve en kolay mikropipet konumlandırılmış fizyolojik bir tepki ortadan kalkması (örneğin, vazodilatasyon veya hücre içi kalsiyum ACh ejeksiyon üzerine bir artış) tarafından deneysel olarak belirlenir. hedef site mesafeler tanımlanmıştır. Pratikte, etkin difüzyon mesafesi önemli ölçüde mikropipet ucu doku yerleştirilmiş nasıl etkilenir; doku ve ucu içine basılı ucu tıkalı ise, örneğin, ejeksiyon engelli daha. Aşırı bağ dokusu oldukça zahmetli ve cerrahi hazırlanması sırasında doku yüzeyinin uzaklaştırılması gerekir. Dikkat ajan ucu tüketen olasılığı da verilmelidir. Bu nispeten kısa bakliyat (örneğin, ≤ 1 ler) kullanılarak en aza indirilmiştir. Sürekli akımlar (örneğin, birkaç saniye) ile agonist mikropipet dökme dolum çözüm difüzyon ile değiştirilmesi daha ucundan daha hızlı bir şekilde sınır dışı olabilir.
Biri (örneğin, + uyaran bir depolarizan K sağlamak için) yerel iyonik ortam değiştirmek için çalışıyoruz. Halinde önemsiz hacmi, microiontophoresis ile yerinden. Çünkü, bu etkili bir şekilde microiontophoresis ile başarılı değil. Fakat kolayca istenilen dökme sıvı basıncı ejeksiyon ile sağlanır. bileşimi. Bir arteriyol yerel uyarılması için, iç çapları 2-3 mikron ile mikropipet ipuçları ejeksiyon basıncını 4-5 psi (28-35 kPa) ve bir solenoid valf 10 ile kontrol darbe süresi (örneğin, 1 saniye) ile iyi çalışır. Bir mikrodamar üzerine bir mikropipet bir ajan sürekli teslim gerekli olduğu durumlarda, basınç ejeksiyon uygun iç uç çapı (örneğin, ~ 10 mikron) 11,12 mikropipetler kullanılması tercih edilir. Açık / kapalı sabit basınç kafası iyi tanımlanmış bir stopcock vana ile bilinen bir yüksekliğe bir hidrostatik sütun, ucuz bir sağlar. Akış hızları, pipet ve sürüş basınç iç çapı ile belirlenir. Her zaman olduğu gibi, araç kontrolleri basınç ejeksiyon nonspesifik eylemler dışlamak için gereklidir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |