Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.
Microiontophoresis bringt Stromdurchgang durch eine Mikropipette Spitze zu einer Lösung an einem bestimmten Ort zu liefern innerhalb einer experimentellen Vorbereitung. Microiontophoresis kann synaptischen Transmission 1 durch Bereitstellung von Neurotransmittern und Neuropeptiden auf Neuronen reproduzierbar 2 zu simulieren. Vernachlässigbares Volumen (Flüssigkeit) Verschiebung verhindert mechanische Störung des experimentellen Vorbereitung. Die Anpassung dieser Techniken, um die Mikrozirkulation 3 hat aktiviert Mechanismen der Vasodilatation und Vasokonstriktion auf der mikroskopischen Ebene in vivo 4,5 untersucht werden. Ein wesentlicher Vorteil einer solchen lokalisierte Abgabe ist damit vasomotorische Reaktionen auf an definierten Stellen innerhalb eines mikrovaskulären Netzwerk ohne evozieren systemischen oder reflexive Änderungen in Blutdruck und Gewebedurchblutung und verrät so intrinsischen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersucht werden.
Eine Einschränkung der microiontophoresis ist, dass die genaue Konzentration des Mittels auf die Baustelle geliefert von Interesse schwer zu ermitteln 6 ist. Dennoch, seine Entlassung aus der Mikropipette Spitze proportional zur Intensität und Dauer der Auswurf aktuellen 2,7 ist, kann, so dass reproduzierbare Reiz-Reaktions-Beziehungen leicht unter definierten experimentellen Bedingungen (siehe unten) ermittelt werden. Zusätzliche Faktoren, die microiontophoretic Lieferung mit Konzentration an gelösten Stoffen und deren Ionisierung in Lösung. Der Innendurchmesser der Mikropipette Spitze sollte ~ 1 um oder weniger sein, Diffusions "Leck", die mit einem Sicherungsring aktuellen entgegengewirkt werden kann minimiert werden. So eine äußere (positive) Strom wird verwendet, um ein Kation und ein negativer Strom verwendet werden, um sie innerhalb der Mikropipette halten auszuwerfen.
Herstellung von Mikropipetten mit ausgefeilten elektronischen Abzieher 8 erleichtert. Mikropipetten werden aus Glaskapillaren mit einem Filament, das gezogen wird "Dochte"-Lösung in die Spitze der Mikropipette, wenn sie aus dem Back-End ("verfüllt") gefüllt. Dies wird durch das Einfügen eines Mikrokapillare Rohr verbunden, um eine Spritze mit der Lösung von Interesse und Auswerfen der Lösung in das Lumen der Mikropipette getan. Mikromanipulatoren ermöglichen gewünschte Platzierung der Mikropipetten innerhalb der experimentellen Vorbereitung. Mikromanipulatoren auf einem fahrbaren Untersatz montiert werden rund um die Zubereitung im Sinne der Topographie des mikrovaskulären Netzwerken (entwickelt unten) positioniert werden.
Das vorliegende Protokoll zeigt microiontophoresis von Acetylcholin (ACh + Cl -) auf einer Arteriole der Maus cremaster Muskel-Präparat (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) an Endothel-abhängige Vasodilatation zu erzeugen. Stimulus Lieferung mit digitalisierten Bildaufnahme mit einem elektronischen Auslöser synchronisiert. Die Verwendung von Cx40 BAC-GCaMP2 transgenen Mäusen 9 ermöglicht Visualisierung der intrazellulären Calcium-Reaktionen zugrunde liegenden Vasodilatation in Arteriolen Endothelzellen in den lebendigen Mikrozirkulation.
Die hier beschriebene Protokoll zeigt Methoden für die Vorbereitung und Durchführung von Mikropipetten für microiontophoresis. Lieferung von Acetylcholin wird verwendet, um Calcium-Signalgebung zugrunde liegenden Endothel-abhängige Vasodilatation in Arteriolen der narkotisierten Maus zu illustrieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Distanz, über die ACh erhöht Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz steigt mit der Intensität eines Rückschlags Strom aus dem microiontophoresis Mikropipette (Abbildung 3). Das Fehlen von Fluoreszenz-Anstieg unter Ruhebedingungen zeigt vernachlässigbar Austreten von ACh aus der Mikropipette. Der Mangel an Reaktion auf 100 nA Reizintensität (Abbildung 3, Legende) zeigt, dass eine Schwelle Intensität der Stimulation für Endothelzellen Kalzium zu erhöhen ist nicht erforderlich. Diese Techniken können ohne weiteres auf andere vasoaktive Substanzen und Gewebe Vorbereitungen angepasst werden.
Praktische Überlegungen: In Zusammenarbeit mit microiontophoresis zu arteriolären Reaktivität Studie, einige Dinge sollten anerkannt werden. Während sie sich bewährt hat schwierig, die tatsächliche Konzentration des Agonisten geliefert zu bestimmen, sind Reiz-Reaktions-Kurven reproduzierbar innerhalb und zwischen den Präparaten. Diese können durch Halten Pulsdauer konstant (z. B. 500 ms) und die Variation der Auswurf Strom (; Abbildung 3 z. B. 250, 500 und 1000 nA) durchgeführt werden. Alternativ können Auswurf aktuellen konstant gehalten werden (zB 500 nA) und Pulsdauer variiert (z. B. 250, 500 und 1000 ms). Für einen Verweis auf die Aktionen eines definierten Agonistkonzentration kann die Zubereitung mit der entsprechenden Lösung 5 superfundiert werden. Da die treibende Kraft für gelöste Auswurf ist elektrische Ladung Bewegung, muss der Agent zu liefernden tragen eine Nettoladung von der Mikropipette verschoben werden. Um sicherzustellen, dass der Agent von Interesse primären Ladungsträger ist, wird es in hoher Konzentration (z. B. 1 M für ACh) aufgelöst, um Elektro-Osmose zu minimieren. Wenn diese Manipulation des pH-Wertes der Mikropipette Füllung Lösung erfordert, sind auf ein Fahrzeug steuert verpflichtet, eine unspezifische Effekte zu ermitteln. Entsprechende Kontrollen sollten auch für die Durchfahrt der aktuellen alleine durchgeführt werden (zB mittels Mikropipetten mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllt). Die tatsächliche Reichweite für die Diffusion des Wirkstoffes aus dem Ort der Freisetzung sollte sichergestellt werden, und ist am ehesten empirisch durch das Verschwinden einer physiologischen Reaktion (z. B. Gefäßerweiterung oder ein Anstieg der intrazellulären Calcium auf Auswerfen der ACh) bestimmt als Mikropipette bei positioniert ist definierten Abständen aus der Ziel-Site. In der Praxis ist der effektive Diffusionsweg stark durch, wie die Spitze der Mikropipette wird im Gewebe positioniert beeinflusst, z. B. wenn die Spitze nach unten in das Gewebe und die Spitze gedrückt verschlossen ist, als Auswurf beeinträchtigt wird. Übermäßige Bindegewebe ist besonders problematisch und sollte von der Gewebeoberfläche bei chirurgischen Präparation entfernt werden. Augenmerk sollte auch auf die Möglichkeit, die zum Abbau der Spitze des Beauftragten gegeben werden. Dies wird durch relativ kurze Impulse (zB ≤ 1 s) minimiert. Bei anhaltend Strömen (zB einige Sekunden), kann die Agonisten von der Spitze vertrieben schneller sein, als es durch Diffusion aus der Schüttung Lösung in der Mikropipette ersetzt werden kann.
Da vernachlässigbares Volumen mit microiontophoresis verdrängt wird, wenn man versucht, die lokale ionische Milieu zu ändern (zB um eine depolarisierende K liefern + Stimulus), kann dies nicht effektiv mit microiontophoresis erreicht werden, ist aber leicht mit Druck Ausstoß von Bulk-Flüssigkeit mit den gewünschten erreicht Zusammensetzung. Für die lokale Stimulation einer Arteriole, Arbeit Mikropipettenspitzen mit einem Innendurchmesser von 2-3 um auch mit Auswurf Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) und Pulsdauer (zB 1 Sekunde) mit einem Magnetventil 10 gesteuert. Wo verzögerten Abgabe eines Agenten aus einer Mikropipette auf eine microvessel erforderlich ist, wird Druck Auswurf bevorzugt mit Mikropipetten geeignete interne Spitzendurchmesser (zB ~ 10 pm) 11,12. Eine hydrostatische Säule bekannter Höhe mit einem Absperrhahn bietet eine kostengünstige, on / off konstantem Druck Kopf gut definiert. Der Durchfluss durch den inneren Durchmesser der Pipettenspitze und der treibende Druck bestimmt. Wie immer, sind auf ein Fahrzeug steuert wichtig, unspezifische Maßnahmen der Druck Auswurf auszuschließen.
The authors have nothing to disclose.
Forschung in der Autoren-Labor wird durch die National Institutes of Health gewährt R37-HL041026, R01-HL086483 und R01-HL056786 (SSS) und F32-HL097463 und T32-AR048523 (PB) von der United States Public Health Service unterstützt.
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |