Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.
Microiontophoresis כרוך במעבר של זרם דרך טיפ micropipette לספק המומס באתר ייעודי בתוך הכנה ניסיונית. Microiontophoresis יכול לדמות הילוכים הסינפטי 1 על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים נוירופפטידים על נוירונים reproducibly 2. נפח זניח (נוזל) עקירה נמנעת הפרעה מכנית הכנה הניסוי. התאמת בטכניקות אלה כדי microcirculation 3 אפשרה מנגנוני התרחבות ו vasoconstriction להיחקר ברמה המיקרוסקופית in vivo 4,5. יתרון המפתח של משלוח מקומי כזה המאפשר תגובות וזומוטורים להיחקר באתרים מוגדרים בתוך רשת כלי הדם מבלי לעורר שינויים מערכתיים או רפלקסיבי בלחץ הדם זרימת הדם לרקמות, ובכך חושפים מאפיינים מהותיים של microvessels.
הגבלה של microiontophoresis היא כי הריכוז המדויק של סוכן נמסר לאתר של עניין קשה לברר 6. עם זאת, השקתו מקצה micropipette הוא יחסי עוצמת ומשך פליטה הנוכחית 2,7, כגון לשחזור כי הגירוי תגובה קשרים ניתן לקבוע בקלות תחת תנאים ניסויים מוגדר (המתואר להלן). גורמים נוספים המשפיעים על משלוח microiontophoretic כוללים ריכוז המומס ואת יינון שלה בתמיסה. הקוטר הפנימי של קצה micropipette יש ~ 1 מיקרומטר או פחות כדי למזער את "דליפה" diffusional, אשר ניתן לסתור עם זרם שמירה. לכן זרם החוצה (חיובי) משמש כדי להוציא קטיון ואת זרם שלילי בשימוש לשמור אותו בתוך micropipette.
המצאה של micropipettes הוא הקל עם מושכי אלקטרוניים מתוחכמים 8. Micropipettes המגיעים צינורות זכוכית נימי המכיל נימה כי "פתילות" פתרון אל קצה micropipette כאשר מלא מקצה האחורי ("backfilled"). הדבר נעשה על ידי החדרת צינור microcapillary מחובר מזרק המכיל את הפתרון לעניין פתרון ולהוציא לתוך לומן של micropipette. Micromanipulators לאפשר המיקום הרצוי של micropipettes תוך הכנת הניסוי. Micromanipulators רכוב על בסיס מטלטלין ניתן למקם סביב הכנת בהתאם לטופוגרפיה של רשתות כלי הדם (שפותחה בהמשך).
הפרוטוקול הנוכחי מדגים microiontophoresis של אצטילכולין (ACH + Cl -) על עורקיק הכנה השריר עכבר cremaster (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) כדי לייצר האנדותל תלויי התרחבות. משלוח Stimulus מסונכרן עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות ההדק אלקטרוניים. השימוש Cx40 BAC-GCaMP2 העכברים הטרנסגניים 9 תגובות מאפשר הדמיה של סידן תוך תאי הבסיס התרחבות בתאי האנדותל arteriolar ב microcirculation האורחים.
פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטות להכנת ויישום micropipettes עבור microiontophoresis. מסירה של אצטילכולין משמש כדי להמחיש איתות סידן התרחבות הבסיסית האנדותל תלויי ב arterioles של העכבר בהרדמה. התוצאות שלנו להמחיש כי המרחק שעליו אח מגבירה תא האנדותל סידן מגביר את הקרינה עם עוצמת פליטה הנוכחית מ micropipette microiontophoresis (איור 3). חוסר להגדיל הקרינה בתנאים מנוחה מציין זליגת זניח של אח של micropipette. חוסר תגובה לגירוי בעוצמה NA 100 (איור 3, אגדה) ממחישה כי עוצמת סף גירוי נדרש סידן תא האנדותל כדי להגדיל. טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות סוכני vasoactive אחרים ההכנות רקמות.
שיקולים מעשיים: בעבודה עם microiontophoresis ללמוד תגובתיות arteriolar, כמה דברים צריך להיות מוכר. אמנם הוכיחה קשה לקבוע את ריכוז בפועל של אגוניסט נמסר, בתגובה לגירוי עקומות ולייצר בתוך ובין ההכנות. אלה ניתן לבצע על ידי לחיצה משך דופק קבוע (למשל, 500 ms) לבין משתנים פליטה הנוכחי (למשל, 250, 500 ו – 1000 NA; איור 3). לחלופין, פליטה הנוכחי ניתן לקיים קבוע (למשל, 500 NA) והדופק משך מגוונים (למשל, 250, 500 ו 1000 ms). לקבלת התייחסות לפעולות של ריכוז אגוניסט מוגדר, הכנת ניתן superfused עם הפתרון המתאים 5. בגלל הכוח המניע פליטה המומס תנועה מטען חשמלי, הסוכן יועברו לשאת מטען נטו להיות שעזבו micropipette. על מנת להבטיח כי הסוכן של עניין היא נושאת מטען ראשוני, הוא מומס בריכוז גבוה (למשל, 1 M עבור ACH) כדי למזער אלקטרו אוסמוזה. כאשר זה דורש מניפולציה של ה-pH של התמיסה מילוי micropipette, פקדי הרכב נדרשים לוודא תופעות ספציפי. בקרות מתאימות צריך גם להתבצע למעבר הנוכחי בלבד (למשל, באמצעות micropipettes מלא מלוחים איזוטוני). המרחק יעיל דיפוזיה של הסוכן שלה מהאתר של שחרור יש לוודא והוא נקבע על ידי רוב בקלות אמפירית היעלמותו של תגובה פיזיולוגית (למשל, התרחבות או עלייה סידן תאיים על פליטה של ACH) כמו micropipette ממוקמת מוגדרים מרחקים מאתר היעד. בפועל, המרחק דיפוזיה יעילה מושפעת במידה רבה על ידי האופן שבו קצה micropipette ממוקם בתוך הרקמה, למשל, אם קצה לחוץ לתוך הרקמה ואת קצהו הוא occluded, מאשר פליטה נפגעת. רקמת חיבור מופרז הוא בעייתי במיוחד, יש להסיר מפני השטח רקמות במהלך הכנת כירורגית. שימו לב צריך גם לתת אפשרות של depleting קצה סוכן המיועד. זה ממוזער באמצעות פולסים קצרים יחסית (למשל, ≤ 1 ים). עם זרמים ממושך (למשל, מספר שניות), אגוניסט עשוי להיות מגורש מקצה במהירות רבה יותר מאשר הוא יכול להיות מוחלף על ידי דיפוזיה מפתרון מילוי בתפזורת ב micropipette.
בגלל נפח זניח מוחלפת עם microiontophoresis, אם הוא מנסה לשנות את הסביבה יוניים המקומית (למשל, כדי לספק K depolarizing גירוי +), זה לא יכול להתבצע ביעילות עם microiontophoresis אבל מושגת בקלות עם פליטה לחץ של נוזלים בצובר לאחר הרצוי הרכב. לגירוי מקומי של עורקיק, טיפים micropipette עם קוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר לעבוד היטב עם הלחץ פליטה 4-5 psi (28-35 kPa) ואת הדופק משך (למשל, 1 שנייה) שבשליטת עם שסתום סולנואיד 10. איפה אספקה מתמשכת של סוכן מן micropipette על microvessel נדרש, פליטה הלחץ הוא העדיף להשתמש micropipettes בקוטר המתאים קצה פנימית (למשל, ~ 10 מיקרומטר) 11,12. טור ההידרוסטטי של גובה ידוע עם שסתום שסתום מספק זול, מוגדרים היטב on / off ראש לחץ מתמיד. שיעורי זרימה נקבעים על ידי בקוטר הפנימי של קצה פיפטה והלחץ נהיגה. כמו תמיד, פקדי הרכב חיוניים כדי למנוע פעולות ספציפי של פליטה הלחץ.
The authors have nothing to disclose.
מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R37-HL041026, R01-R01 HL086483 ו-HL056786 (SSS) ועל ידי F32-HL097463 ו-T32 AR048523 (PB) משירות ארצות הברית לבריאות הציבור.
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |