Microiontophoresis влечет за собой перемещение ионов из микропипетки в ответ на разность электрических потенциалов между внутренней и внешней микропипетки. Биологически активные молекулы таким образом доставляется в пропорции к электрическим током. Проиллюстрируем ацетилхолина microiontophoresis в сочетании с микроманипуляция изучать эндотелий-зависимой вазодилатации в микроциркуляции.
Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be ˜ 1 μm or less to minimize diffusional ‘leak’, which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that ‘wicks’ solution into the tip of the micropipette when filled from the back end (“backfilled”). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below).
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl–) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.
Протокол, описанный здесь, демонстрирует методы подготовки и реализации микропипетки для microiontophoresis. Доставка ацетилхолина используется для иллюстрации кальциевой сигнализации основной эндотелий-зависимой вазодилатации в артериолы наркозом мыши. Наши результаты показывают, что расстояние, на котором АЧ увеличивает эндотелия увеличивает кальция клетка флуоресценция с интенсивностью выброса тока от microiontophoresis микропипетки (Рис. 3). Отсутствие флуоресценции увеличение в состоянии покоя указывает незначительной утечки АЧ из микропипетки. Отсутствие реакции на 100 нА интенсивности раздражения (рис. 3, легенды) показывает, что пороговая интенсивность стимуляции требуется для эндотелиальных кальция клетка увеличивается. Эти методы могут быть легко адаптированы для других вазоактивных агентов и тканевые препараты.
Практические соображения: В работе с microiontophoresis изучать артериол реактивности, несколько вещей, которые должны быть признаны. Хотя это оказалось трудным для определения фактической концентрации агониста доставлен, стимул-реакция кривые воспроизводимых внутри и между препаратами. Они могут быть выполнены путем проведения постоянной длительности импульса (например, 500 мс) и различной выброса тока (например, 250, 500 и 1000 нА, рисунок 3). Кроме того, выброс ток может быть постоянным (например, 500 нА) и длительностью импульса разнообразны (например, 250, 500 и 1000 мс). Для ссылки на действия определен агонист концентрации, препарат может быть superfused с соответствующим решением 5. Потому что движущей силой для растворенного вещества выброса электрического движения заряда, агент должен быть доставлен нести суммарный заряд быть перемещены из микропипетки. Чтобы убедиться, что агент интересов первичных носителей заряда, он растворяется при высокой концентрации (например, 1 м для АЧ), чтобы минимизировать электроосмос. Когда это требует манипулирования рН раствора заполнения микропипетки, транспортное средство контроля необходимо установить какой-либо неспецифических эффектов. Соответствующие элементы управления должны быть выполнены для прохождения тока в одиночку (например, с помощью микропипетки заполнены изотонический солевой раствор). Эффективное расстояние для диффузии агент от своего сайта релиз должен быть установлен и является наиболее легко определить эмпирическим путем исчезновения физиологического ответа (например, расширение кровеносных сосудов или повышение внутриклеточного кальция на выброс ацетилхолина) в качестве микропипетки позиционируется на определены расстояния от целевой сайт. На практике эффективная длина диффузии в значительной степени зависит от того, как кончик микропипетки позиционируется в ткани, например, если кончик нажатой в ткани и ее наконечник окклюзии, чем выброс нарушается. Чрезмерное соединительной ткани особенно хлопотным и должны быть удалены из поверхности ткани во время хирургической подготовки. Внимание следует также уделить возможности истощения кончик назначенным агентом. Это сводится к минимуму, используя сравнительно коротких импульсов (например, ≤ 1 с). С устойчивой токов (например, несколько секунд), агонистов может быть исключен из кончика быстрее, чем он может быть заменен путем диффузии из объема заполнения решение в микропипетки.
Потому что незначительный объем смещается с microiontophoresis, если он пытается изменить местных ионной среде (например, для доставки деполяризующего K + стимул), это не может быть эффективно достигнуто с microiontophoresis но легко достигается при давлении выброс жидкости в объеме оказывает желаемого композиции. Для местных стимуляции артериол, микропипетки советы с внутренним диаметром 2-3 мкм хорошо работать с выбросом давлением 4-5 МПа (28-35 кПа) и длительности импульса (например, 1 секунду) управляется с электромагнитного клапана 10. Где устойчивой доставки агента из микропипетки на микрососудов требуется, давление выброса является предпочтительным использованием микропипетки соответствующих внутренним диаметром наконечника (например, ~ 10 мкм) 11,12. Гидростатической колонки известных высота с клапаном крана обеспечивает недорогое, четко определенные включения / выключения постоянного напора давление. Расход определяется внутренний диаметр кончика пипетки и вождение давления. Как всегда, транспортное средство контроля необходимы для исключения неспецифической акции давления выброса.
The authors have nothing to disclose.
Исследования в лаборатории авторов при поддержке Национального института здравоохранения грантов R37-HL041026, R01-R01 и HL086483-HL056786 (SSS) и F32-HL097463 и T32-AR048523 (РВ) из Общественного США службы здравоохранения.
Material Used | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | model P-97 | |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
5 ml syringe | Becton-Dickinson Co. | 309603 | |
Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
3-axis micromanipulator | Siskiyou Design Instruments | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments | Model 260 | |
trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8″ X 12″ X 12″ | According to design |
Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |